摘要：目的探究蛋白激酶9 (PK9)在约氏疟原虫生长发育中的作用。方法基于疟原虫PlasmoDB数据库,查找约氏疟原虫致死株17XL (Py17XL)的PK9序列信息, BLAST比对Py PK9和恶性疟原虫PK9(Pf PK9)以及人蛋白激酶p78的同源性。提取Py17XL株野生型(WT)基因组DNA,设计引物, PCR扩增PK9基因。采用CRISPR-Cas9技术,将同源臂与sgRNA序列一起连接到PYC-MCS质粒中,构建PK9基因敲除(PK9KO)重组质粒。重组质粒电转至Py17XL虫株内,经乙胺嘧啶筛选、克隆,进行PCR鉴定和测序。10只雌性BALB/c小鼠随机分为WT感染组和PK9KO感染组,每组5只,重复3次实验。每鼠腹腔注射1×105个红内期疟原虫,每隔24 h取血检测小鼠原虫血症,观察小鼠存活情况。200只3~5日龄的斯氏按蚊随机分为WT感染小鼠吸血组和PK9KO感染小鼠吸血组,每组100只。于吸血8 d后解剖蚊胃,每组随机选取15只斯氏按蚊进行解剖,测定蚊胃中卵囊的数量。10只雌性BALB/c小鼠随机分为WT子孢子感染组和PK9KO子孢子感染组,每组5只,重复2次实验。每鼠尾静脉注射1×103个子孢子,每隔12 h取血,涂片观察其原虫血症出现时间。结果Py PK9与Pf PK9的序列一致性为82.5%, Py PK9和人类蛋白激酶p78的一致性为39.4%。PK9基因PCR扩增产物的长度约为597 bp。经PCR鉴定、测序确定PK9KO重组质粒构建成功, Py17XL虫株成功敲除PK9基因。WT感染组小鼠迅速出现原虫血症,感染后5~6 d全部死亡, PK9KO感染组小鼠全部存活,原虫血症在感染后17 d消失。WT感染小鼠吸血组和PK9KO感染小鼠吸血组的斯氏按蚊感染率分别为60.0%(9/15)和66.7%(10/15),差异无统计学意义(P> 0.05)。WT子孢子感染组和PK9KO子孢子感染组小鼠均于72 h查见原虫血症。结论PK9在红内期Py17XL的毒力中发挥了重要作用。