检测猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性和经典毒株可视化RT-LAMP方法的建立

摘要：猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是目前影响养猪业的重要病毒之一,国内PRRSV是以美洲型为主,根据致病性的强弱又可分为高致病性(HP)和经典性PRRSV毒株,高致病性PRRSV是引起国内2006年'猪高热病'的主要病原。PRRSV属于条件性致病病毒,对PRRSV感染猪和发病猪的准确、快速检测是采取有效措施的前提和依据。环介导等温扩增技术(LAMP)是一种敏感、快速、操作相对简便的核酸扩增技术,整个反应在单一温度下进行,反应结果可以通过肉眼观察,在动物病原检测方面应用较多。本试验通过GenBank获得了HP-PRRSV和经典PRRSV分离株序列,选择2种毒株共同的保守基因区段,设计了用于检测PRRSV的RT-LAMP引物。通过对反应体系、反应温度、特异性、敏感性等优化,建立了检测PRRSV的RT-LAMP方法。建立的方法总体系为25μL,外引物终浓度为0.20μmol/L、内引物终浓度为1.60μmol/L,63.0℃恒温作用1 h,给反应产物中加入1μL SYBR GreenⅠ,阳性结果呈绿色,紫外光下可见荧光,阴性结果呈橙色,紫外光下无荧光。方法对PRRSV RNA的最低检测质量浓度为9.44×10-5 mg/L。用建立的方法对临床送检的19份猪样品(血清和组织)进行检测,与国标(GB/T 27517-2011)的HP-PRRSV和PRRSV双重RT-PCR检测方法进行对比,双重RT-PCR方法检测出6份阳性,RT-LAMP方法检测出8份阳性。本试验建立了检测PRRSV经典毒株和高致病毒株的RT-LAMP方法,为PRRSV的检测提供了可选择的方法。