FⅧ His99Arg突变导致血友病A的分子发病机制研究

摘要：目的探讨1例临床出血表现与凝血因子Ⅷ活性（Fvm：C）检测结果明显不符的血友病A患者表型、基因型诊断及其分子发病机制。方法凝血、抗凝及纤溶相关指标检测，一步法及发色底物法检测FⅧ：C，ELISA法检测FⅧ的抗原（FVIH：Ag）。活化部分凝血活酶时间（APTr）纠正实验筛查FⅧ抑制物；PCR扩增先证者F8基因的所有外显子及其侧翼序列，利用直接核苷酸测序法进行基因序列分析。针对先证者的基因突变位点，对其家系成员进行相应外显子基因检测；定点突变法构建B亚基缺失（760aa～1639aa）的人FⅧHis99Arg和His99Ala两种突变的表达质粒（pRC／RSV—BDhFⅧcDNA），两种突变质粒分别瞬时转染HEK293T细胞，测定细胞上清液中的FⅧ：C和细胞上清液及裂解液中的FVIU：Ag。结果先证者APTT延长，一步法及发色底物法检测的FⅧ：C均低于1．0％，血浆FⅧ：Ag为120．0％。APTT纠正试验阴性，其他凝血、抗凝及纤溶相关检测均未见异常。诊断为交叉反应阳性（CRM＋）的血友病A。患者F、8基因直接核苷酸测序发现3号外显子存在28828A→G突变，导致His99Arg氨基酸改变，其母亲该位点为杂合突变。体外表达研究结果显示细胞上清液中His99Arg突变蛋白FⅧ：Ag及FⅧ：C分别为野生型的180．0％及5，8％，His99Ala突变蛋白FⅧ：Ag及FⅧ：C分别为野生型的45．0％和20．0％。Western blot显示，His99Arg突变质粒表达上清液中FⅧ蛋白含量较野生型明显增高，而His99Ala突变质粒表达上清液FⅧ蛋白含量较野生型减少。提示His99Arg为CRM＋血友病A突变而His99Ala为CRM-血友病A突变。结论体外检测发现His99Arg和His99Ala两种FVI能够表达，但常规凝血检测His99Arg突变FⅧ基本无功能，而His99Ala凝血功能也降低。