人组织因子途径抑制因子在毕赤酵母中高拷贝表达

摘要：目的构建高拷贝表达重组人组织因子途径抑制因子的毕赤酵母并对蛋白表达条件进行初步优化，为相关研究奠定基础。方法将PCR扩增得到的TFPIcDN段与表达质粒pPIC9K连接构建重组质粒rhTFPI—pPIC9K，采用PCR方法及DNA测序对其进行鉴定。将重组质粒转化酵母细胞GSI15，利用G418抗性实验筛选含有高拷贝TFPIcDNA的毕赤酵母菌株，采用WesternBlot和TFPI检测试剂盒分析重组蛋白表达。通过改变诱导温度、诱导时间及甲醇浓度对重组蛋白表达条件进行初步优化。结果PCR扩增rhTFPI-pPIC9K得到预期的扩增条带（1．2kb），经酶切图谱分析及测序确认成功构建表达质粒rhTFPI—pPIC9K。实时定量PCR结果显示，通过G418筛选获得了含高拷贝基因的酵母细胞，WesternBlot结果显示含基因拷贝数与蛋白表达量呈正相关。通过对表达条件的优化，明显提高了TFPI重组蛋白的表达量，重组TFPI表达量高达（9．95±0．78）mg／L，活性达到（3．91±1．37）U／mL。结论成功构建了高效表达TFPI重组蛋白的毕赤酵母细胞株，为TFPI功能研究及在相关疾病防治中的应用提供了坚实的实验基础。