干细胞培养技术篇(1)

细胞工程课程在生物科学专业的设置

本课程自从2007年在我校新办生物技术专业开设以来，根据学校对本科生物技术专业的培养计划，细胞工程是生物技术专业的主干课程，并于2009－2010学年第二学期开始开设。通过对该课程的教学，使学生掌握细胞工程所涉及的基本概念、原理、技术方法、应用基础等内容。通过近三年的教学实践，不断加强课程建设与发展，理论教学体系已经基本完善，实验教学平台基本建立。通过全面进行教学改革，已逐渐形成本校建设的特色课程。21世纪，生命科学全面快速发展。根据学科发展和社会需求趋势，在新办生物技术专业基础之上，2009年我校新办生物科学专业。然而，新办生物科学专业的困境是专业范围宽泛;如何在有限的时间内，全面、高效地培养适应社会需求的合格人才，是每位任课教师和教学管理者必须认清的首要问题。为了充分发挥我们医学院校的资源优势，在培养学生方向定位上，以健康教育为主要方向，兼顾生物制药等，但又与生物技术的培养方式不同。由于细胞工程是由细胞生物学、分子生物学、基因工程、工程学等学科理论技术有机结合的一门崭新学科，因而被设定为新办生物科学专业本科生培养计划的必修课程。

细胞工程课程在生物科学中的开设，是以普通生物学、生物化学、医学遗传学、细胞生物学、分子生物学、微生物学、免疫学等先修课程为基础。同时，将本课程的学习与基因工程、生物技术等课程的学习互相补充和相互促进，为将来从事生命科学基础理论研究、生物制品的开发和应用、疾病诊断技术的开发与应用等领域的工作打下必要的基础。在教材方面，以李志勇编著《细胞工程》(高等教育出版社)为基本教材，以杨吉成编著《细胞工程》(化学工业出版社)、安利国编著《细胞工程》(第二版，科学出版社)等为主要参考教材。在教师队伍配置方面，既有细胞生物学领域教学经验丰富的教授，也有年富力强的专业知识扎实的中青年骨干教师。细胞工程的理论教学和实验教学全部由既具有扎实生物工程学相关知识背景，又有基础细胞理论与实验技术背景的骨干教师承担。

细胞工程教学内容的设定与改革

细胞工程课程的特色，是以细胞工程技术方法的基本原理为课程教学切入点。在教学内容上，基本理论的讲授与技术方法过程的介绍并重;在本学科知识的系统性方面，既有本学科理论的系统性，又加强与其他相关学科的相互渗透交叉，尤其是以细胞生物学、生物工程的基础知识背景，为本学科的理论教学奠定基础;通过将现有技术的原理、应用归纳，与本学科相关技术的发展趋势讲解相结合;从内容上，客观系统地反映本学科相关领域应用前景、重点研究方向和尚待解决的科学问题;在理论上自成体系。根据教学计划，细胞工程在我校总学时设定为80学时，其中理论50学时，实验30学时。本课程的开设，一般在第三学年的第二学期，在普通生物学、生物化学、医学遗传学、细胞生物学、组织胚胎学等课程修完之后进行。细胞工程在教学内容、教学方法上又与以上学科大不相同，本课程教学是以技术方法的原理为基础理论的学科，因此实验与理论教学并重。细胞工程课程的理论课程内容，根据研究对象一般分为三大部分内容，分别为:细胞工程概论与基本技术、植物细胞工程、动物细胞工程。根据我校的教学实际情况和培养计划，我们对教学内容进行了适当的改革与调整。课程的内容重点在第一部分细胞工程概论与基本技术和第三部分动物细胞工程［1－4］。

干细胞培养技术篇(2)

【关键词】造血干细胞；体外扩增；3D支架

【Abstract】Hematopoietic stem cells （HSCs） have both self-renewal and differentiation potential and could be differentiated into blood and immune systems. 3 d scaffolds can simulate the bone marrow microenvironment in vivo， therefore， here is to make a review on the 3D scaffold Advances in the Expansion of Hematopoietic Stem Cells in vitro.

【Key words】Hematopoietic stem cells； Ex vivo expansion； 3D scaffold

造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）是存在于造血组织中的一群原始造血细胞，也可以说它是一切血细胞的原始细胞。造血干细胞移植技术已得到全世界的认可，并成为根治白血病等疾病的主要手段，为人类战胜疾病带来新的希望。造血干细胞体外扩增具有重要的临床和高端科研意义，造血干细胞体外扩增培养可以保证有足够多的细胞数量供于患者造血干细胞移植，同时也是一项极具挑战的技术。

1 造血干细胞

造血干细胞的来源主要包括骨髓、外周血和脐带血。骨髓中造血干细胞含量高，但从骨髓中获取造血干细胞需要通过骨髓穿刺技术，对供者的伤害较大。经过 G-CSF 动员后的外周血造血干细胞比例增加，成为现在临床上造血干细胞移植最重要的来源[1]。脐带血造血干细胞含量丰富，且异体排斥反应小，免疫原性低，再生能力强，但其总体体积小，仅适用体重较轻的儿童患者，很难满足对于成人造血干细胞移植的需要[2]。因此，科学家在体外有效扩增造血干细胞方面做了很大努力。

造血干细胞具有2个重要的特征：高度的自我更新或自我复制能力，是一种多能干细胞[3]。造血干细胞移植可治疗恶性血液病，部分恶性肿瘤，部分遗传性疾病等75种致死性疾病[4]。

2 3D支架在造血干细胞体外扩增中的应用

研究表明3D培养对于提高干细胞的体外扩增倍数，延长体外培养时间和维持的自我更新能力有显著效果。3D支架培养能很好的模拟造血干细胞微环境的三维组织结构。细胞在支架上的生长、移植和内生长率直接依赖于支架的多孔结构、孔隙率、孔的直径和孔的形状。目前，三维培养支架材料有天然材料和合成材料两大类。

2.1 天然材料支架

天然支架材料主要有胶原蛋白、透明质酸类等ECM成分。ECM成分在细胞的粘附、存活、增殖、分化及干性维持中发挥着重要的作用。天然的ECM主要是从组织脱细胞提取或者培养细胞合成分泌获得。

胶原蛋白支架： Isabelle Leisten等[5]以8份体积的酸性胶原和1份体积的10×DMEM培养基混合后，以2M NaOH中和溶液；再分别加入1份体积的间充质干细胞培养基或含间充质干细胞的培养基，所得悬浮液转移至24孔板内，在37℃条件下孵育1h，获得无细胞或含间充质干细胞的胶原凝胶，造血干细胞单一培养、骨髓间充质干细胞或脐血间充质干细胞共培养。在细胞培养过程中，除了使用传统的液体培养体系，还采用了2种3D龛模型对比，龛I为造血干细胞悬浮于胶原凝胶上方；龛II为造血干细胞迁移至胶原酶I消化处理的胶原凝胶内。龛I条件下细胞增殖，且含造血干细胞（CD34+/CD38-）、老化髓细胞（CD38+、CD13+、CAE+）和NK细胞（CD56+）等多种细胞，龛II条件下造血干细胞有较高水平的原始CD34+/CD38-表型和髓系分化（CD13+、CAE+），类似于骨髓龛的骨内膜部位，而脐血间充质干细胞共培养体系不适于造血干细胞扩增。所以说，胶原蛋白和骨髓间充质干细胞的基质支持体系可有效成功地扩增造血干细胞，为研究造血作用的机制如增殖、分化、凋亡和间质改变提供了良好的模型，也可以作为血液疾病的药物筛选平台。

透明质酸水凝胶支架： 透明质酸水凝胶由透明质酸和ADH交联物长链和EDCI组成，制备方法为：透明质酸和ADH交联物溶解于去离子水中，PH调至4.6，加入碳二亚胺试剂（EDCI）水溶液，轻轻搅动2h形成凝胶；以0.1N NaCl盐析2天形成透明质酸水凝胶，再分别置于25%乙醇溶液和去离子水内放置2天去除未反应的ADH和EDCI；制备的凝胶于冻干器内冻干，冻干品于-20℃保存，使用前加热灭菌处理。透明质酸水凝胶支架可在不添加额外细胞因子的条件下培养和扩增造血干细胞，体外扩增28天的克隆形成率为传统培养法的280倍。以Pronectin F Plus？R包被和非包被的透明质酸水凝胶支架对造血干细胞扩增无明显差别[6]。

纤维蛋白支架： Ferreira MS等[7]在无菌条件下，混凝血酶、人凝血蛋白原自制悬浮液（由纤维蛋白原、CaCl2、GBSH5缓冲液组成），于37℃条件下聚合反应20min，得到所需的3D纤维蛋白支架。该支架孔径2-50μm，纤维直径0.3μm，支架直径6500μm，高2000μm，细胞生长体积为67mm3。支架无菌处理后置于96孔板中，接种脐血间充质干细胞和造血干细胞的重悬液。与3D PLGA meshes、3D InsertTM-PCL和3D OptiMaixTM-collagen 三种支架相比，新制备的3D纤维蛋白支架培养体系细胞增殖最高，培养14天的总有核细胞扩增了5×108倍，培养7天的CD34+细胞扩增了3×107倍；分裂细胞原始免疫表型更高；形态学、迁移和黏附性能更优；骨髓、脾脏和血液长期移植的NSG小鼠体内实验中也表现出最强的移植和多向分化能力。因此，该支架为脐血扩增和移植临床应用的最佳选择。

细胞制备的无细胞支架： MS-5细胞以去离子水孵育2～3min使细胞贴壁状态松弛，0.02M NH4OH室温孵育1～2min促进细胞裂解。基质干燥过夜，储存于PBS液中，4℃保存，得到所需生物支架[8]，成功用于脐血造血干细胞的扩增。

藻酸盐支架：袁燕等[9]将脐血单核细胞重悬于1.1%藻酸盐或1.1%藻酸盐-0.1%明胶溶液，混匀后通过27-g针头逐滴加入100mM氯化钙溶液中，旋转6～10min使形成的固态微球硬化成型；然后转移至培养皿中即为三维静止培养体系。该体系能在降低生长因子用量的同时有效地提高脐血造血干细胞的扩增效率和CD34+ 比例。

2.2 合成支架

近年来，多种合成可降解聚合物如聚乙二醇（PEG）、聚二甲硅氧烷（PDMS）、聚己酸内酯（PCL）和聚乙烯对苯二甲酸酯（PET）等在组织工程领域被广泛应用，它们有良好的生物相容性、机械性能可控以及便于加工等优点。

PEG支架： Raic A等[10]通过盐析技术制备PEGDA水凝胶，NaCl晶体为致孔剂。333mg PEG-DA溶解在1mL饱和NaCl溶液中，加入终浓度为20μMRGDSK-PEG-丙烯酸盐，黑暗条件下130rpm旋转30mim；200mg PEGDA前驱溶液和800mg 40～100μm大小的NaCl晶体混合转移至一个48孔板的孔中，加入APS、TEMED，迅速混合得到聚合胶状物；切成2mm大小的胶块，再以去离子水溶解致孔物NaCl；当用于细胞培养时，胶块置于乙醇内，在-20℃条件下放置2天，随后冻干；冻干胶紫外灭菌处理后加入细胞悬液和培养基。制备的3D支架与间充质细胞、成骨细胞样细胞作为骨髓微环境成分共培养，比传统2D培养更能保持造血干/祖细胞的多能性。

PEG/PCL支架： Jung YJ等[11]也以盐析原理制备了PEG/PCL水凝胶支架，但没有选择APS和TEMED作为引发剂，而是用AIBN于70℃、12h条件下促进自由基交联反应；该支架可维持造血干细胞的自我更新和造血系统重塑能力，造血干细胞在PEG/PCL为6/14的水凝胶支架条件下生长状态最好。

2.3 复合型材料支架

在实际细胞培养应用中，多采用几种生物材料复合应用，以弥补单一成分的不足，增强多方优点，更好的模拟ECM结构，满足不同的需要。

纤连蛋白包被的PCL支架： PCL支架以50μg/ml的纤连蛋白在4℃包被24h，培养的脐血造血干细胞总细胞数目和CD34+细胞数分别增加了58倍和40倍，而2D培养仅为38倍和2.66倍[12]。

胶原蛋白1包被的PDMS支架：生物相容性材料PDMS被设计成含200μm直径微孔，旋转包被胶原蛋白1，以模拟骨髓微环境。将纯化的CD133+细胞接种于微孔中，并添加细胞因子TPO、FL、SCF体外培养，同时，为了对比，另取细胞接种于24孔板中体外培养，其它条件相同，其3D支架培养的细胞比2D培养有更高的扩增倍数和较低的分化率[13]。

3 3D支架应用过程中需要考虑的问题

不同培养体系培养的细胞最佳临床应用可能存在差异。例如，胶原-磷酸钙粘合支架培养的脐血造血干细胞矿化作用更多，有更多的成骨表达，有希望用于骨科和颅面整形术[14]。以盐析方法制备的PCL支架包被鼠尾胶原蛋白I，在存在角质细胞和成纤维细胞的条件下培养的脐血造血干细胞倾向于T细胞分化和原始淋巴结形成，有希望用于先天性造血和免疫功能失调的患者[15]。

与传统的2D细胞培养法相比，采用3D支架体系培养方法可以更有效的扩增造血干细胞。但是若要收集细胞则需要更多的步骤处理，如胰酶消化，这可能会损伤及减少细胞数目。Madlambayan等[16]设计了一个静态生物加工模式，包含两个用磁性装置分开透气的培养袋，用以除去不需要的细胞。用该方法培养的总细胞数、CD34+、CFU和LTC-IC细胞扩增倍数分别达到了24.6±3.6、30.8±7.2、31.3±5.8和32.6 ±7.5倍。

4 小结与展望

随着细胞因子、蛋白和小分子药物激动剂的鉴定及3D培养技术的迅速发展，造血干细胞的体外扩增技术已经趋近成熟。体外细胞培养的一个重要原则是需模拟体内细胞生长环境，该模拟系统中的核心因素是细胞与培养环境之间的相互作用。目前，干细胞研究蓬勃发展，再生医学科学方兴未艾，组织工程学研究和应用也已凸显出广阔的应用前景和巨大的市场空间。在造血干细胞治疗和干细胞组织工程领域，模拟体内微环境进行造血干细胞体外扩增可以保证造血干细胞状态稳定，增殖量大，是该领域走向产业化的必然趋势。

【参考文献】

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[10]Raic A， R？idling L， Kalbacher H， et al. Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells[J]. Biomaterials， 2014， 35（3）： 929-940.

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干细胞培养技术篇(3)

一、 热点题型分析

热点题型1 对比体内、外受精及其早期胚胎发育过程，解答胚胎工程原理题

例1 下列有关哺乳动物和卵细胞的发生以及受精作用的叙述中，正确的是（ ）

A. 采集到的和卵细胞相遇即可发生受精作用

B. 排卵就是排出成熟卵细胞的过程

C. 卵细胞形成时的分裂过程均在卵巢内完成

D. 受精作用完成的标志是在卵黄膜和透明带之间观察到两个极体

解析 本题考查、卵细胞的形成及体外受精的知识。熟记、卵子及受精过程是正确解答该题的关键。采集到的必须经获能处理后才能受精，采集的卵细胞若是通过冲卵取出的，则不需要培养直接就可与获能的受精，若从卵巢取出的卵细胞则需要培养成熟后才可以与获能的受精；排卵排出的可能是初级卵母细胞或次级卵母细胞，而不是成熟的卵细胞；哺乳动物卵细胞形成的场所，未排卵之前是在卵巢进行的，排卵之后减数分裂的继续完成则是在输卵管中。

答案 D

例2 下图表示蛙的受精卵发育至囊胚过程中，DNA总量、每个细胞体积、所有细胞体积之和、有机物总量的变化趋势（横坐标为发育时间）。其中正确的是（ ）

A. ①② B. ①③

C. ②④ D. ③④

解析 本题考查的是动物早期胚胎发育过程中物质及细胞结构变化情况。熟悉胚胎的早期发育过程是正确解答该题的关键。受精卵发育成囊胚的过程中，需要通过细胞的有丝分裂，使细胞数目增多。该过程中每个细胞DNA含量不变；所有细胞中总DNA量为2N・2N，呈指数函数形式增长；囊胚的总体积不变，但由于细胞数目增多，故每个细胞的体积减小。细胞有丝分裂过程需要消耗能量，能量由细胞呼吸过程中有机物氧化分解产生，故有机物总量在减少。

答案 A

例3 请回答下列与哺乳动物和卵子发生有关的问题：

（1） 精细胞经变形后，高尔基体发育形成的顶体，顶体内含有的_______能协助穿过卵母细胞的放射冠和透明带。

（2） 某动物排卵时，减数第一次分裂尚未完成，此时卵子处于_________卵母细胞阶段。当该细胞发育至减数第二次分裂______期时，才具备受精能力。若在卵黄膜和透明带之间看到两个极体，则表明_________过程已完成。

（3） 动物的早期胚胎移植到同种且____

________与供体相同的动物体内，使之继续发育为新个体的技术叫做胚胎移植。为了获得更多的早期胚胎，常用______________激素对供体进行处理，其目的是获得更多的___

___________，经人工授精后可得到早期胚胎。用某染料鉴定胚胎细胞是否为活细胞时，发现活胚胎细胞不能被染色，其原因是活细胞膜_______________。

（4） 若要通过胚胎移植获得遗传物质完全相同的两个新个体，可对发育到桑椹胚或囊胚阶段的早期胚胎进行______________处理，再植入到受体内。若要对早期胚胎进行长期保存，应将其置于______________条件下。

解析 本题考查受精作用过程。熟记具体受精过程是正确解答该题的关键。（1） 顶体内含有的顶体酶能协助穿过卵母细胞的放射冠和透明带。（2） 动物排卵时处于减数第一次分裂的细胞称为初级卵母细胞，减数第二次分裂中期的细胞才具备受精能力，受精作用完成的标志是在卵黄膜和透明带之间看到两个极体。（3） 胚胎移植时受体的生理状态要和供体一致，才能保证胚胎成活。为了获得更多的早期胚胎，常用促性腺激素对供体进行处理，其目的是获得更多的卵母细胞。细胞膜具有选择透过性，活胚胎细胞不能被染色，原因是细胞膜对染料的吸收具有选择性。死细胞会被染色，因为细胞膜失去选择透过性。（4） 若要通过胚胎移植获得遗传物质完全相同的两个新个体的常用方法是胚胎分割，要注意胚胎一定要分割均匀。生物学中常采用液氮冷冻的方法保存早期胚胎和生殖细胞。

答案 （1） 顶体酶

（2） 初级 中 受精

（3） 生理状态 促性腺 卵母细胞 对物质的吸收具有选择透过性

（4） 胚胎分割 冷冻（或液氮）

题型攻略

【知识储备】和卵子的发生过程的几个重点问题分析：

（1） 哺乳动物卵泡的形成和在卵巢内的储备，是在出生前（即胎儿时期）完成的，这是和卵子在发生上的重要区别，但不是唯一的区别，如发生场所、过程及结果也不相同。

（2） 的发生中两次减数分裂是连续的，是在的曲细精管内进行的。卵子的发生中两次减数分裂是不连续的，减数第一次分裂在卵巢内完成，产生一个次级卵母细胞和第一极体，进入输卵管，在与的结合过程中完成减数第二次分裂，产生一个成熟的卵子和第二极体。当原核融合时，第一极体完成分裂，形成2个第二极体。有的哺乳动物的第一极体不再分裂。

（3） 不同种动物的形态相似，大小略有不同，但与动物的体型大小无关。

（4） 哺乳动物卵巢、卵泡和卵子的关系。

卵巢是卵子形成、卵泡存在的场所，内部包含许许多多不同发育阶段的卵泡，而成熟的卵泡中可释放出卵子，其中卵子的外面有辅助结构――透明带，由卵丘细胞（卵泡细胞）形成放射冠，而卵子外面的胞膜即卵黄膜。排卵指卵子从卵泡中排出，而非卵泡从卵巢中排出。

【易错指导】

（1） 对卵裂阶段，细胞的物质含量和体积大小的变化模糊不清：

① 误认为卵裂阶段的细胞分裂方式包括减数分裂，实际上在该过程中只进行有丝分裂。

② 误认为卵裂阶段细胞中有机物、DNA的含量要增多，细胞体积要增大。受卵膜制约，从受精卵到囊胚阶段总体积不变或略有减小，所以每个细胞体积减少；伴随细胞分裂，细胞数目增多，总DNA含量增多，但每个细胞中DNA含量保持相对稳定；该过程中有机物总量减少，因为一直通过呼吸消耗，但不能从外界吸收。

（2） 不能对胚胎发育与胚胎工程中的有关概念进行正确的区分

① 对、卵子的发生、发育和结合场所不熟；发生场所――曲细精管；卵子的发生场所――卵巢和输卵管；受精场所――输卵管；发育场所――输卵管和子宫；发生时间及特点――初情期后，两次分裂连续进行；卵子发生时间及特点――胚胎性别分化以后，两次分裂不连续。

② 不能正确区分受精的标志和受精完成的标志。看到两个极体是受精的标志，雌雄原核膜融合是受精完成的标志。

③ 对囊胚和桑椹胚在胚胎发育过程中所处的阶段、特点和在胚胎工程中的应用没有完全掌握；胚胎发育过程中开始分化的阶段是囊胚，可以移植或分割的阶段为桑椹胚和囊胚。

④ 忽略“透明带反应”和“卵黄膜的封闭作用”在受精过程中的生物学意义；两者构成了防止多精入卵的两道屏障。

⑤ 体外受精易忽视“获能”和“卵子成热”问题。

热点题型2 关注胚胎工程的应用趋势，解答胚胎工程应用题

例4 胚胎干细胞研究在医学上有重大应用价值。通过移植胚胎干细胞期望可以治疗的疾病是（ ）

①糖尿病 ②血友病 ③唐氏综合征（21三体综合征） ④老年痴呆症 ⑤白化病

⑥肝衰竭 ⑦镰刀型细胞贫血症

A. ①②⑤⑦ B. ②③④⑥

C. ①②④⑥⑦ D. ②③④⑤

解析 本题考查胚胎干细胞的应用。理解胚胎干细胞的特点、弄清题目所给疾病的病因是正确解答该题的关键。糖尿病、老年痴呆症和肝衰竭分别是胰岛B细胞、神经细胞和肝细胞受损或衰老引起的疾病，有望通过移植胚胎干细胞的方法加以治疗。血友病和镰刀型细胞贫血症虽然是由于遗传物质改变引起的疾病，其致病基因只在血细胞中表达，只影响血液的功能，有望通过移植造血干细胞的方法加以治疗。唐氏综合征（21三体综合征）和白化病也是遗传物质改变引起的疾病，但影响范围大，不能用移植胚胎干细胞方法进行治疗。

答案 C

例5 自然情况下，牛的生育率很低，通过现代科技手段，可以实现良种牛的快速繁殖。请按照提示，回答下列问题：

（1） 使一头良种雄性黄牛，在一年内繁殖数百头后代，最简便的方法是__________。

（2） 现有一头良种雌性黄牛，采用胚胎移植的方法，可使这头良种牛一年生下数十头自己的后代。其操作过程中需要用激素对该良种母牛（供体）和代孕母牛（受体）进行__

________处理；还要用激素使供体母牛_____

_____。胚胎收集的过程也叫做__________。用于移植的胚胎应发育到__________或____

______阶段。

（3） 采用试管动物技术还可以使普通雌性黄牛产下奶牛、良种肉牛等不同品种小牛。该技术中首先要做的是体外受精和_______。体外受精主要包括__________、__________和__________等几个主要步骤。

解析 本题要求运用胚胎工程的技术手段，快速繁殖良种牛。熟记胚胎工程的技术手段是正确解答该题的关键。（1） 通过人工授精的方法，可以在短时间内大量繁殖优良品种。（2） 胚胎移植进行前，首先要对供体母牛和代孕母牛进行同期处理，同时还要用激素处理供体母牛使其超数排卵；人工收集发育到桑椹胚或囊胚阶段的胚胎进行移植。（3） 试管动物技术包括体外受精和胚胎早期培养，体外受精又包括的采集和获能、卵母细胞的采集和受精三个阶段。

答案 （1） 人工授精

（2） 同期 超数排卵 冲卵 桑椹胚 囊胚

（3） 早期胚胎的培养 卵母细胞的采集

的采集和获能（的获取） 受精

例6 克隆羊的成功不仅奠定了疾病克隆性治疗的基础，又解决了器官移植中供体不足的问题，同时也给人类带来了一些过去尚未遇到的问题。下图为人类对克隆羊技术的拓展图和应用。请据图回答问题。

（1） 图中所涉及的现代生物技术有____

____________________等。（至少写三个）

（2） （多选）下列有关胚胎移植的叙述中，正确的有（ ）

A. 冲卵指的是从子宫中冲出胚胎，而非冲出卵子

B. 只有供、受体生理环境高度一致，移入受体的胚胎才能被接受，并继续发育

C. 供体和受体要进行免疫检查，防止发生免疫排斥反应

D. 不同动物其胚胎移植的时间不同，人的胚胎移植最好在四细胞阶段进行

（3） 图中两个婴儿长大后，外貌、性格和其他特征与原型男人基本相同，这说明_____

_______具有全能性。

（4） 使用培养基进行胚胎干细胞培养时，通常要加入___________等天然成分，除了保证被培养细胞处于无菌、无毒及充足氧气的环境中，还需要保证细胞生活所需的__________和__________；早期胚胎发育在__________阶段以前的细胞是全能细胞。

（5） 图中从“内细胞团到胚胎干细胞”的培养过程中，必须用_________处理内细胞团，使之分散成单个细胞。干细胞形成组织、器官必须要进行__________和__________。

（6） 在体外培养胚胎干细胞能否获得动物器官？__________为什么？____________

_________________。

解析 本题考查胚胎工程的应用及胚胎干细胞的培养与应用，熟记核移植、胚胎移植、胚胎分割等相关过程和胚胎干细胞等相关概念是正确解答该题的关键。

（1） 获得重组细胞，主要采用核移植技术。重组细胞到早期胚胎，涉及到细胞培养。胚胎进入代孕母体，则采用胚胎移植。早期胚胎分为胚胎1和2，通过胚胎分割。

（2） 大量研究表明，受体对移植入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排排斥，这是能够进行胚胎移植的生理基础之一。

（3） 2个婴儿的遗传物质主要来自供核的亲本，将来与供核的亲本外貌很相似。

（4） 由于人们对细胞所需营养物质还没有全搞清楚，因此在在使用合成培养基时，通常加入血清、血浆等天然成分。桑椹胚细胞还没有出现分化，因此认为是全能性细胞。

（5） 胰蛋白酶能使细胞分散开来。

（6） 通过胚胎干细胞体外诱导分化，还可以培育出人造组织器官。但胚胎干细胞在饲养层细胞上或在添加抑制因子的培养液中，能够维持不分化的状态。

答案 （1） 核移植、胚胎移植、细胞培养

（2） ABD

（3） 动物体细胞核

（4） 血清 温度 pH 桑椹胚

（5） 胰蛋白酶 细胞分裂 细胞分化

（6） 不能 胚胎干细胞在体外培养条件下可以增殖而不发生分化

题型攻略

【知识储备】 试题出现的与“胚胎工程”高频知识点总结：

（1） 胚胎移植是胚胎工程中最后一道程序，移植的胚胎必须在原肠胚之前，不能直接移植受精卵。

（2） 移植胚胎来源及生殖方式：核移植后进行早期胚胎培养（无性生殖）；体外受精后进行早期胚胎培养（有性生殖）；体内受精冲卵胚胎移植（有性生殖）。

（3） 促性腺激素两次处理：①同期处理；②超数排卵。

（4） 两次检查：①收集胚胎检查；②移植后是否妊娠检查。

（5） 对囊胚进行分割时，要注意将内细胞团均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。

【易错指导】

（1） 误认为胚胎移植过程中的冲卵冲出的是卵子；应该是早期胚胎，而不是冲出卵子。体外受精过程中的冲卵冲出的是卵子。

（2） 误认为高等哺乳动物的卵子就是成熟的、已经完成减数分裂的卵细胞；实际上能和结合的卵子的主要部分是处于减数第二次分裂中期的次级卵母细胞，在与的结合过程中完成减数第二次分裂。

（3） 因为胚胎干细胞的分裂能力强、分化程度低，误认为胚胎干细胞的体积也较大；实际上胚胎干细胞的特征是体积小、核大、核仁明显。

巩固训练

1. 下列关于哺乳动物胚胎发育和胚胎工程的叙述中，正确的是（ ）

A. 胚胎干细胞具有发育全能性，它可发育成新个体

B. 滋养层细胞发育成胎膜和胎盘是在囊胚期

C. 诱导胚胎干细胞分化的培养基中不需要加入饲养层细胞

D. 胚胎工程的操作对象是受精卵，而不是生殖细胞

2. “试管婴儿”技术是通过将不孕夫妇的和卵细胞取出在试管中完成受精，并在试管中培养使其发育成早期胚胎，再将胚胎移入女性子宫内发育成胎儿。它不仅使一部分不能生育的男女重新获得了生育的机会，也为人类的优生开辟了新的途径。“试管婴儿”所涉及的技术和原理不包括（ ）

A. 克隆技术 B. 细胞膜融合

C. 细胞培养 D. 胚胎移植

3. 在试管牛的生产过程中，不是必需的操作是（ ）

A. 卵母细胞的采集和培养

B. 受精卵中导入抗病毒基因

C. 的采集和获能

D. 胚胎的早期培养和移植

4. 科学家已成功地利用人体表皮细胞制造出了具备胚胎干细胞功能的细胞（即类胚胎干细胞），下列有关叙述中，错误的是

（ ）

A. 表皮细胞是高度分化的细胞

B. 类胚胎干细胞能够分化成多种细胞

C. 表皮细胞和类胚胎干细胞具有相同的基因组

D. 表皮细胞在形成过程中丢失了某些基因

5. 哺乳动物的下列四种生理活动发生的顺序是（ ）

①透明带反应 ②透明带破裂

③顶体反应 ④卵黄膜封闭

A. ①②③④ B. ③①④②

C. ④③②① D. ①③②④

6. 高等哺乳动物受精后不久，受精卵开始进行细胞分裂。经桑椹胚、囊胚、原肠胚和组织器官的分化，最后发育成一个完整的幼体，完成胚胎发育的全过程，下列有关叙述错误的是（ ）

A. 右图是胚胎发育过程中囊胚期示意图，①、②、③依次称之为透明带、滋养层、内细胞团

B. 高等哺乳动物胚胎发育经历的时期是受精卵卵裂期桑椹胚囊胚期原肠胚期幼体，其中最关键的时期是原肠胚期

C. 高等哺乳动物胚胎发育中的细胞分化开始于囊胚期，终止于生命结束

D. 进行胚胎分割时，应选择原肠胚期的胚胎进行

7. 科学家已成功地利用人体表皮细胞制造出了具备胚胎干细胞功能的细胞（即类胚胎干细胞），下列有关叙述中，错误的是

（ ）

A. 类胚胎干细胞与人体表皮细胞相比，功能有差异，形态、结构也有差异

B. 类胚胎干细胞和表皮细胞中的DNA、mRNA和蛋白质都完全相同

C. 表皮细胞在形成过程中基本上没有丢失基因

D. 人体表皮细胞的质核比（细胞质/细胞核的比值）比类胚胎干细胞的大

8. 为了加快优良种牛的繁殖速度，科学家采用了以下两种方法：

请根据图示信息回答：

（1） 试管牛和克隆牛的培育过程中均用到的工程技术有________、________等。

（2） 用来促进B牛多排卵的激素可能是________分泌的促性腺激素。对D牛要进行________处理。此外受体对移入子宫的外来胚胎基本上不发生________反应，这为胚胎在受体内的存活提供了可能；判断卵子是否受精的标志是________。在受精的过程中，首先发生________反应释放出有关的酶直接溶解卵丘细胞之间的物质。防止多精入卵的生理反应有________。E牛的性别是________。为了确保得到所需性别的试管牛，往往需要对移植前的胚胎进行性别鉴定，请举出两种对早期胚胎进行性别鉴定的方法（只需写出名称或简要原理）____________。

（3） 产生F牛的理论依据是________，其生殖方式属于________。请再举一例克隆牛的培育技术________。

（4） 要培育高产奶率的转基因牛，如建立的生产生长素的生物反应器，即：科学家将________重组在一起，通过_________等方法，导入牛的__________中，转基因牛乳腺细胞中含有较多的参与分泌物加工的________等细胞器。

9. 请回答下列有关细胞工程和胚胎工程的问题：一对健康夫妇生下一男婴，1岁时脑出血死亡，2年后女方怀孕6个月时，经羊水及脐带血诊断为男孩且患血友病，遂引产。于是夫妇俩到广州中山医附属一院做试管婴儿。医生培养7个活体胚胎，抽取每个胚胎1~2个细胞检查后，选两个胚胎移植，最后一个移植成功，出生了一健康女婴，她是我国第三代试管婴儿。请回答：

（1） 试管婴儿技术作为现代生物技术和母亲正常怀孕生产的过程的相同之处是____

________，不同点在于____________。

（2） 医生抽取活体胚胎的1或2个细胞后，可通过观察____________判断早期胚胎的性别，你认为医生应选用______性胚胎进行移植，应用现代生物技术，现在人们已能够选取最理想的胚胎，其基因型应该是_______

_____。自然状态下，出现这样的胚胎的概率是____________。该实例体现了现代科学技术应用于社会和人类生活的重要意义。

（3） 供体器官的短缺和排斥反应是制约器官移植的两个重要问题。而治疗性克隆能最终解决这两个问题。下图是治疗性克隆的过程图解：

Ⅰ. 请在上图中横线上填上适当的术语：①____________；②____________。

Ⅱ. 上图中的③④表示的生理过程是__

__________。

10. 胚胎移植的基本程序如下图，据图回答下列问题：

（1） 对供体母牛、受体母牛进行的①处理是_________。处理的方法是_________。

（2） 在哺乳动物的受精过程中，有哪些机制可以防止多个入卵受精__________

_________________________________。

（3） 在输卵管内，次级卵母细胞的减数第二次分裂是在___________________过程中完成的。判断卵子是否受精的重要标志是____________________________。

（4） 冲卵之后要进行质量检查，这时的胚胎应发育到____________阶段。

（5） 哺乳动物排卵后，不管是否妊娠，在一段时间内，同种动物的供、受体_____

_____________是相同的，这就为供体的胚胎移入受体提供了相同的生理环境。供体胚胎移入受体后可与受体子宫建立___________，但移入受体的供体胚胎的遗传特性，在孕育过程中_____________________。

（6） ②处理是_____________。

（7） 在胚胎工程中通过任何一项技术，如________________________等技术获得的胚胎，都必须移植给受体才能获得后代。

参考答案

1. C 2. A 3. B 4. D

5. B 6. D 7. B

8. （1） 动物细胞培养 胚胎移植

（2） 垂体 同期 免疫排斥 在透明带和卵黄膜间有两极体 顶体 透明带反应和卵黄膜封闭作用 雌性或雄性 DNA分子杂交技术（利用基因探针鉴定），分析胚胎细胞的染色体组型

（3） 动物细胞核的全能性 无性生殖

胚胎分割

（4） 生长激素基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件 显微注射法 受精卵 内质网、高尔基体、线粒体

9. （1） 双亲生殖细胞都融合为合子 试管婴儿是体外受精，胚胎移植的产物 （2） 性染色体形态 女 XBXB 1/4 （3） Ⅰ. ①细胞核 ②内细胞团细胞 Ⅱ. 细胞分化

10. （1） 同期 用促性腺激素处理

（2） 透明带反应、卵黄膜封闭作用

（3） 和卵细胞结合 在卵黄膜和透明带的间隙里可以观察到两个极体

（4） 桑椹胚或囊胚

（5） 生殖器官的生理变化 正常的生理和组织联系 不受任何影响

干细胞培养技术篇(4)

例1某生物体内有基因A，该基因能控制合成A蛋白，A蛋白是某种药物的有效成分，下图是将A基因导入大肠杆菌内，制备“工程菌”的示意图。据图回答：

（1）获得基因A有两条途径：一是以A的mRNA为模板，在酶的催化下，合成双链DNA，从而获得所需基因；二是根据目标蛋白质的序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测其DNA的序列，再通过方法合成所需基因。

（2）利用PCR技术扩增DNA时，需要在反应体系中添加的有机物质有、、4种脱氧核糖核苷酸和酶，扩增过程可以在PCR扩增仪中完成。

（3）下列关于各种酶作用的叙述，不正确的是。

A.DNA连接酶能使不同脱氧核苷酸的磷酸与脱氧核糖连接

B.RNA聚合酶能与基因的特定位点结合，催化遗传信息的转录

C.一种DNA限制酶能识别一种核糖核苷酸序列

D.胰蛋白酶能作用于离体的动物组织，使其分散成单个细胞

（4）图中的C称为，在基因工程中，常用Ca2+处理D，处理后D更易，此时D称为。

（5）图中最后一步“筛选”是指从转化细胞中筛选出能的大肠杆菌作为工程菌。

【知识要点复习】（1）利用反转录法合成目的基因的过程是：以mRNA为模板，在逆转录酶的催化下，合成单链的DNA，逆转录酶具有DNA聚合酶活性，在它的作用下，可合成双链DNA；根据蛋白质来获得目的基因的过程是：根据目标蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测其DNA的脱氧核苷酸序列，再通过人工合成方法合成所需基因。

（2）PCR过程中需要引物、模板DNA、4种脱氧核糖核苷酸和热稳定性DNA聚合酶等物质，故在PCR反应体系中应添加这些物质。

（3）DNA连接酶能使不同脱氧核苷酸的磷酸与脱氧核糖连接，形成磷酸二酯键，A项正确；RNA聚合酶能与基因上的RNA聚合酶结合位点结合，催化遗传信息的转录，B项正确；一种DNA限制酶能识别一种“脱氧核糖核苷酸序列”而不是“核糖核苷酸序列”，C项错误；胰蛋白酶能将离体的动物组织细胞间质中的胶原蛋白分解，使其分散成单个细胞，D项正确。

（4）由图可知，A为目的基因，B为运载体，二者结合在一起，形成的C称为重组DNA（或重组质粒）。将目的基因导入微生物细胞，常用Ca2+处理受体细胞，使之更易吸收周围环境中的DNA，成为感受态细胞，提高受体细胞的转化率。

（5）目的基因导入受体细菌，是否可以稳定维持和表达其遗传性，可通过检测与鉴定，得到稳定遗传并能表达出A蛋白的细菌作为工程菌。

【答案】（1）逆转录氨基酸脱氧核苷酸

人工合成（化学）（2）引物模板DNA热稳定性DNA聚合（3）C（4）重组DNA（或重组质粒）吸收周围环境中的DNA感受态细胞（5）稳定遗传并能表达出A蛋白

二、胚胎工程、基因工程和细胞工程的综合命题

例2毛角蛋白Ⅱ型中间丝（KIFⅡ）基因与绒山羊的羊绒质量密切相关。获得转KIFⅡ基因的高绒质绒山羊的简单流程图如下。

（1）过程①中最常用的运载工具是，这里也可以用动物病毒或作为运载工具，所需要的酶是限制酶和。

（2）在过程②中，用处理将皮肤组织块分散成单个成纤维细胞。在培养过程中，将成纤维细胞置于和5% CO2的混合气体培养箱中进行培养，培养液中加入达到无菌环境，将成纤维细胞置于5% CO2的气体环境中，CO2的作用是。

（3）在过程③中，用处理以获取更多的卵（母）细胞。成熟卵（母）细胞在核移植前需要显微操作将吸出，处理后得到去核的卵母细胞。

（4）从重组细胞到早期胚胎过程中所用的胚胎工程技术是。在胚胎移植前，通过技术可获得较多胚胎，此技术若选囊胚作材料，应注意的事项是。

【知识要点复习】（1）将KIFⅡ基因导入成纤维细胞内，获得转KIFⅡ基因的高绒质绒山羊的过程采用了转基因技术，而转基因技术的原理是基因重组，过程①是基因表达载体的构建过程，该过程中最常用的运载工具是质粒，此外也可用动植物病毒及λ噬菌体的衍生物作为运载工具，此处不宜用植物病毒；所需要的酶是限制酶和DNA连接酶。

（2）过程②为动物细胞培养过程，该过程需用胰蛋白酶（或胶原蛋白酶）处理，使皮肤组织块分散成单个成纤维细胞，动物细胞培养需要一定的气体环境，即95%空气加5% CO2，CO2的主要作用是维持培养液的pH值。细胞培养需要无菌和无毒的环境，因此培养液中需加入（一定量的）抗生素以达到无菌环境。

（3）过程③表示活体采卵，该过程需用促性腺激素处理母羊使其超数排卵，以获取更多的卵（母）细胞，在体外培养到减数第二次分裂中期时，通过显微操作进行去核处理，将细胞核和第一极体一并吸出。

（4）从重组细胞到早期胚胎过程需采用（早期）胚胎培养技术。在胚胎移植前，通过胚胎分割技术可获得较多胚胎，此技术若选囊胚作材料，应注意的事项是将内细胞团均等分割。

【答案】（1）质粒λ噬菌体的衍生物DNA连接酶（2）胰蛋白酶（或胶原蛋白酶）95%空气（一定量的）抗生素维持培养液的pH值（3）促性腺激素细胞核和第一极体

（4）（早期）胚胎培养技术胚胎分割将内细胞团均等分割

三、细胞工程和胚胎工程的综合命题

例32015年2月3日，英国议会下院通过一项历史性法案，允许以医学手段培育“三亲婴儿”。三亲婴儿的培育过程可选用如下技术路线。

（1）此过程涉及试管婴儿的培育，它属于（填“无性”或“有性”）生殖，试管婴儿的培育用到的技术手段有：体外受精技术、技术和技术。

（2）该技术培育的“三亲婴儿”的染色体来自细胞，其细胞质基因来自细胞。

（3）据图分析，该技术（填“能”或“不能”）避免母亲的红绿色盲遗传病基因传递给后代，该技术能避免母亲的遗传性视神经病变遗传给后代，推测该疾病的致病基因位于上。

（4）细胞核移植技术一般选择减数第二次分裂中期的卵母细胞作为受体细胞，其原因有：①卵母细胞质内存在激发细胞核全能性表达的物质；②；③。

（5）高产奶牛“卢辛达”的培育也用到了细胞核移植技术，其过程大致如下图所示：

其中供体细胞来自（填“高产奶牛”或“普通奶牛”），将供体细胞注入去核的卵母细胞的透明带中，通过方法使两细胞融合，供体核进入受体卵母细胞中，体现细胞膜的特点；常用方法激活重组细胞，使其完成细胞分裂和发育。如果要提高重组胚胎的利用率，可对期的胚胎进行分割以获得多个可用于移植的胚胎，暂时不移植的胚胎可用方法保存。

【知识要点复习】（1）“三亲婴儿”的获得涉及“试管婴儿技术”，应属于有性生殖，体外受精技术得到受精卵后需要通过早期胚胎培养技术得到可用于胚胎移植的桑椹胚或囊胚，然后进行胚胎移植。

（2）通过题图分析可知，核移植是将母亲卵母细胞的核移植到捐献者去核的卵母细胞中，所以受精卵的细胞核内含有来自母亲的遗传物质和来自的父亲的遗传物质，而受精卵的细胞质基因几乎全部来自捐献者的去核的卵母细胞。

（3）母亲的红绿色盲遗传病基因可以通过细胞核进入受精卵，所以该技术不能避免母亲的红绿色盲遗传病基因传递给后代，该技术能避免母亲的遗传性视神经病变遗传给后代，因此“遗传性视神经病变”应属于细胞质基因控制的遗传病，即致病基因位于线粒体DNA上。

（4）细胞核移植技术一般选择减数第二次分裂中期的卵母细胞作为受体细胞，其原因有：①卵母细胞质内存在激发细胞核全能性表达的物质；②卵母细胞体积大，便于操作；③卵黄多，营养物质丰富，有利于早期的胚胎发育。

（5）高产奶牛“卢辛达”的培育属于克隆，其中供体细胞为高产奶牛的体细胞，其操作流程如下：

将供体细胞注入去核的卵母细胞的透明带中，通过电刺激方法使两细胞融合，供体核进入受体卵母细胞中形成重组细胞，重组细胞还需通过物理或化学方法（如电脉冲、钙离子载体、乙醇等）激活才能继续分离和发育成重组胚胎。如果要提高重组胚胎的利用率，可对桑椹胚或囊胚期的胚胎进行分割以获得多个可用于移植的胚胎，暂时不移植的胚胎可用冷冻方法保存。

【答案】（1）有性早期胚胎培养（或动物细胞培养）胚胎移植（2）母亲的卵母细胞和捐献者的卵母（3）不能线粒体DNA（或细胞质DNA）（4）②卵母细胞体积大，便于操作③卵黄多，营养物质丰富（5）高产奶牛电刺激流动性物理或化学桑椹胚或囊胚冷冻

四、动物细胞工程和免疫知识的综合命题

例4下图是利用单克隆抗体技术制备三聚氰胺特异性抗体的过程。请据图回答：

（1）单克隆抗体的制备是动物细胞工程中技术的重要应用，该技术依据的原理是，而动物细胞培养依据的原理是。

（2）B淋巴细胞是由动物体内细胞增殖、分化、发育而来，主要参与动物体的免疫过程；单克隆抗体的制备所基于的免疫学基本原理是。

（3）由于三聚氰胺分子量过小，不足以激活高等动物的免疫系统，因此在制备抗体前必须对其进行①过程，下列物质中不适合作协助“扩容”抗原分子的是（）

A.蛋白质B.多糖

C.磷脂D.核苷酸

（4）③过程采用与植物细胞原生质体融合相同的诱导方法有，③过程特有的方法是。

（5）④过程涉及两次筛选，分别筛选出和；单克隆抗体与传统血清抗体相比具有的优点是。

【知识要点复习】（1）单克隆抗体的制备过程是将效应B细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，然后经克隆化培养和抗体检测，最后得到单克隆抗体，所以单克隆抗体技术是细胞融合技术的重要应用；动物细胞融合依据的原理是细胞膜具有一定的流动性；动物细胞培养依据的原理是细胞增殖。

（2）B淋巴细胞是由动物体骨髓中的造血干细胞增殖、分化、发育而来的，主要参与动物体的体液免疫；单克隆抗体的制备所基于的免疫学基本原理是每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。

（3）协助“扩容”抗原分子必须是大分子物质，所以核苷酸作为小分子物质被排除。

（4）植物细胞原生质体融合常用化学方法（聚乙二醇PEG）和物理方法（离心、振动、电刺激）；诱导动物细胞融合的方法有三种，分别是生物方法（灭活的病毒）、化学方法（聚乙二醇PEG）和物理方法（离心、振动、电刺激）。

（5）单克隆抗体制备过程的两次筛选：第一次筛选杂交瘤细胞，第二次筛选产生特异性（抗三聚氰胺）抗体的杂交瘤细胞；单克隆抗体与传统血清抗体相比具有的优点是特异性强、灵敏度高、可大量制备。

【答案】（1）动物细胞融合细胞膜具有一定的流动性细胞增殖（2）造血干体液每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体（3）D（4）化学方法（聚乙二醇）和物理方法（电刺激）生物方法（灭活的病毒）（5）杂交瘤细胞产生特异性（抗三聚氰胺）抗体的杂交瘤细胞特异性强、灵敏度高、可大量制备

五、动物细胞工程和植物细胞工程的综合命题

例5某同学在学习“细胞工程”时，列表比较了动植物细胞工程的有关内容，其中不正确的地方有（）处

植物细胞工程动物细胞工程技术

手段植物组织培养、植物体细胞杂交动物细胞培养和融合、单克隆抗体的制备特殊

处理机械法去除细胞壁胰蛋白酶处理、制备细胞悬浮液融合

方法物理方法、化学方法物理方法、化学方法、生物方法典型

应用人工种子、远缘杂交植株、作物脱毒单克隆抗体的制备、克隆动物培养液

区别蔗糖是离体组织赖以生长的成分动物血清不可缺少，需加一定量抗生素特点植物体细胞杂交技术可定向改造生物的性状单克隆抗体的优点是特异性强、灵敏度高、可大量制备A.3处B.2处

C.1处D.0处

【解析】上表中有两处错误：一处是在植物细胞工程的体细胞杂交技术中去除细胞壁的方法是酶解法，即利用酶的专一性原理，用纤维素酶或果胶酶去除细胞壁；另一处是“植物体细胞杂交技术可定向改造生物的性状”，与传统的有性杂交相比，细胞融合技术的优点在于可以克服远缘杂交障碍，但不能定向改造生物的性状，故B项正确。

【答案】B

六、胚胎工程和减数分裂的综合命题

例6哺乳动物卵原细胞减数分裂形成成熟卵子的过程，只有在促性腺激素和的诱导下才能完成。下图是为获得试管动物记录的某哺乳动物卵子及早期胚胎的形成过程示意图（N表示染色体组数）。请回答：

（1）图中Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ细胞的名称分别为、、；卵裂的细胞分裂方式为。上图中细胞Ⅱ处于细胞分裂后期时染色体数为，细胞Ⅲ处于细胞分裂后期时染色体数为，细胞Ⅳ处于细胞分裂后期时染色体数为。

（2）卵原细胞经两次细胞分裂形成卵子，减数第一次分裂发生在排卵前后，减数第二次分裂发生在过程中。若是体内受精，则受精作用发生的场所是，当观察到卵细胞膜与透明带之间时，说明已经受精，是防止多精入卵的第一道屏障。

（3）试管动物的培育主要包括和两个过程，前者需在获能液或“专门溶液”中完成。

（4）对于试管动物理解正确的是。

A.属于无性生殖

B.属于有性生殖

C.体内发育

D.体外发育

E.运用基因工程技术

F.运用细胞工程技术

【知识要点复习】（1）图中显示卵原细胞经过染色体复制（减数第一次分裂前的间期）成为细胞Ⅱ初级卵母细胞，它在促性腺激素的作用下完成减数第一次分裂，形成细胞Ⅲ次级卵母细胞，次级卵母细胞在减数第二次分裂中期与相遇完成受精作用，继续完成减数第二次分裂形成受精卵，受精卵经过卵裂形成早期胚胎。细胞Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ分别为初级卵母细胞、次级卵母细胞和受精卵，卵裂的细胞分裂方式为有丝分裂。处于细胞分裂后期的Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ细胞中染色体数分别为2N、2N、4N。

（2）卵原细胞经历的两次细胞分裂分别发生在：减数第一次分裂发生在排卵前后，减数第二次分裂发生在受精作用过程中；体内受精发生的场所是输卵管，当观察到卵细胞膜与透明带之间有两个极体出现时，说明已进入卵细胞，卵细胞被激活完成减数第二次分裂，排出第二极体；第一个触及卵细胞膜的瞬间，透明带的穿透性立即发生改变以防止多个进入透明带，这叫透明带反应。

（3）试管动物的培育主要包括体外受精和胚胎移植两个过程。

（4）试管动物的培育属于有性生殖，涉及动物细胞培养技术，未涉及基因工程技术，试管动物的发育是将早期胚胎移入母体（代孕母体）子宫内发育，因此是体内发育，所以选BCF。

【答案】（1）初级卵母细胞次级卵母细胞

受精卵有丝分裂2N2N4N（2）受精作用输卵管有两个极体透明带反应（3）体外受精胚胎移植（4）BCF

七、胚胎干细胞的应用综合命题

例7下图表示利用胚胎干细胞（ES细胞）所作的一系列研究。请据图分析回答问题：

（1）过程Ⅰ将胚胎干细胞置于γ射线灭活的鼠胎儿成纤维细胞的饲养层上，并加入动物血清、抗生素等物质，维持细胞不分化的状态。在此过程中，饲养层提供干细胞增殖所需的，加入抗生素是为了，这对于研究细胞分化和细胞凋亡的机理具有重要意义。

（2）上图中的胚胎干细胞（ES细胞）可以从和中分离获取。过程Ⅱ将带有遗传标记的ES细胞注入早期胚胎的囊胚腔，通过组织化学染色，用于研究动物体器官形成的时间、发育过程以及影响的因素，这项研究利用了胚胎干细胞具有的特点。

（3）过程Ⅲ中目的基因导入胚胎干细胞最常用的方法是，将获得的目的基因转入胚胎干细胞前需构建，需要的工具酶有。

（4）过程Ⅳ得到的小鼠畸胎瘤中里面全是软骨、神经管、横纹肌和骨骼等人类组织和器官。实验时，获得免疫缺陷小鼠的方法是，该过程研究的意义在于解决临床上供体器官不足或器官移植后免疫排斥等问题。

（5）克隆转基因小鼠常用的技术手段有、、早期胚胎培养技术和。

【知识要点复习】（1）胚胎干细胞培养时所用的饲养层细胞可以供给干细胞增殖所需的营养物质，加入抗生素是为了防止杂菌污染。

（2）胚胎干细胞（ES细胞）可以从早期胚胎和原始性腺中分离获取；胚胎干细胞具有发育的全能性，通过组织化学染色，用于研究动物体器官形成的时间、发育过程以及影响因素。

（3）将基因表达载体导入动物细胞最常用的方法是显微注射法，在导入前需构建基因表达载体（完成后称为“重组DNA”），需要的工具酶有限制酶和DNA连接酶。

（4）获得免疫缺陷小鼠的方法有射线照射破坏胸腺法和直接手术摘除胸腺法，这样小鼠就不能形成T细胞，不发生细胞免疫，移植组织细胞就不会被排斥。

（5）克隆转基因小鼠涉及克隆，则涉及细胞核移植技术和胚胎移植技术，该小鼠又是“转基因小鼠”，所以又涉及转基因技术。

【答案】（1）营养物质防止杂菌污染（2）早期胚胎原始性腺发育全能性（3）显微注射法基因表达载体限制酶和DNA连接酶（4）破坏小鼠胸腺（5）核移植技术转基因技术胚胎移植技术

【同步训练】

1.英国科学家维尔穆特首次用羊的体细胞（乳腺细胞）成功地培育出一只小母羊，取名“多利”，这一方法被称之为“克隆”。我国中科院动物所和福州大熊猫研究中心合作，通过将大熊猫的细胞核植入到去核后的兔子卵细胞中，在世界上最早克隆出一批大熊猫早期胚胎，这表明我国的大熊猫人工繁殖技术再次走在世界前列。以下说法正确的是（）

A.在形成早期胚胎的过程中，依次经历了卵裂、囊胚、原肠胚等几个阶段

B.在形成早期胚胎的过程中，尚未出现细胞的分化

C.将兔的早期胚胎分割后，分别植入两只母兔的子宫内，并最终发育成两只一样的兔子，此方法与“多利”的培养本质相同，涉及的技术也完全相同

D.兔子卵细胞质的作用只是激发大熊猫细胞核的全能性

2.下列实践与基因工程的说法不正确的是（）

A.利用DNA探针检测饮用水是否含病毒属于基因工程的运用

B.农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞，目的基因的最终插入位置是在染色体的DNA上

C.选择大肠杆菌作为“工程菌”生产的胰岛素并不具生物活性

D.培育转基因抗虫棉用到了细胞融合技术

3.下列关于基因工程技术的叙述，正确的是（）

A.切割质粒的限制性核酸内切酶均特异性地识别6个核苷酸序列

B.PCR反应中温度的周期性变化是为了配合DNA聚合酶催化不同的反应

C.载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因

D.抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达

4.现有两个烟草品种A（Hhrr）和B（hhRr）的花粉若干（两对基因分别位于两对同源染色体上），利用诱导因素促使原生质体融合（只考虑两两融合）。只要有一对隐性基因纯合（rr或hh）时，在光照强度大于800 lx条件下，就不能生长。下列叙述正确的是（）

①实验开始时必须除去不利于原生质体融合的物质②实验中得到A、B花粉之间融合细胞的基因型有6种③要想从融合细胞的培养液中分离出基因型为HhRr的杂种细胞，可在大于800 lx光照下培养，收集增殖分化的细胞团④从理论上分析，将融合细胞的培养液放在大于800 lx光照下培养，有5种基因型的融合细胞不能增殖分化

A.①②④B.①②③

C.②③④D.①③④

5.某农业生态工程基地按照生态和经济规律，对种植业和养殖业进行了优化设计。

（1）通过套种、间种和等技术的应用，使种植的农作物为该生态系统组成成分中的提供更多的食物。

（2）作为生态农业，他们用作物秸秆作饲料发展畜禽养殖，人畜粪便大力发展沼气池，沼渣用来养鱼，卖到市场增加了效益，这个基地运用了生态工程的等原理。

（3）在农业生产中尽量不施用农药，其目的是。

A.减少水土流失B.减少土壤肥力

C.减少环境污染D.减少生物多样性

6.水稻种子中70%的磷以植酸形式存在，植酸易与蛋白质结合排出体外，是多种动物的抗营养因子，而植酸酶可降解植酸。科学家研究发现酵母菌中含有植酸酶，设想将酵母菌的植酸酶基因导入水稻，培育低植酸转基因水稻品种。下图是获取植酸酶基因的流程，结合所学知识及相关信息回答下列问题：

（1）图中基因组文库cDNA文库（填“大于”或“小于”），B过程需要的酶是。

（2）为获得大量的目的基因，可以用技术进行扩增，其原理是，该过程中需要以图中的或为模板，所用酶的显著特点是。

（3）植酸酶基因能在水稻体内稳定遗传的关键是，可以用DNA分子杂交技术进行检验。

（4）用限制酶处理载体和目的基因后，用酶处理，能连接平末端的酶，形成重组的基因表达载体，该载体的化学本质是。

7.下图是我国南方开始尝试的农业生态系统的结构模式图，其中利用植物秸秆中的原料生产的燃料乙醇，是一种“绿色能源”，可减少对石油资源的依赖。请据图回答：

（1）生态系统的主要功能是和，从生态学角度分析，人们建立图示的农业生态系统的主要目的是。建立该生态工程所遵循的基本原理主要是（至少答两点）等。

（2）植物秸秆经预处理后，应该利用微生物A所产生的纤维素酶进行水解，使之转化成发酵所需的葡萄糖。若从土壤中分离获取微生物A，应采用具有选择功能的培养基，培养基中的碳源为。

（3）为了提高植物秸秆的利用率，可以利用基因工程对微生物A进行改造，其基本方法是：先用同时切割和，然后用DNA连接酶将上述切割产物连接，构建并将其导入到受体菌中。

8.植物甲具有极强的耐旱性，其耐旱性与某个基因有关。若从该植物中获得该耐旱基因，并将其转移到耐旱性低的植物乙中，有可能提高后者的耐旱性。

（1）理论上，基因组文库含有生物的基因；而cDNA文库含有生物的基因。

（2）将耐旱基因导入农杆菌，并通过农杆菌转化法将其导入植物乙的体细胞中，经过一系列的过程得到再生植株。要确认该耐旱基因是否在再生植株中正确表达，应检测此再生植株中该基因的，如果检测结果呈阳性，再在田间试验中检测植株的是否得到提高。

（3）假如用得到的二倍体转基因耐旱植株进行自交，如果子代中耐旱与不耐旱植株的数量比为，则可推测该耐旱基因整合到了同源染色体的一条染色体上；如果子代中表现为，则可推测该耐旱基因整合到了同源染色体的两条染色体上。

【参考答案】

1.A2.D3.D4.D

5.（1）轮种消费者（2）物质循环再生、整体性（物种多样性）（答出两点即可）（3）C

6.（1）大于逆转录酶（2）PCRDNA复制目的基因Ⅰ目的基因Ⅱ耐高温（3）插入（整合）到染色体上的DNA中

（4）DNA连接T4DNA连接DNA

7.（1）物质循环能量流动实现生态系统内能量和物质的多级利用，提高农产品的产量，减少环境污染（合理地调整生态系统中的能量流动关系，提高能量利用率，减少环境污染）物质循环再生原理、整体性原理、物种多样性原理（2）纤维素（3）同种限制性核酸内切酶

目的基因运载体基因表达载体

干细胞培养技术篇(5)

【关键词】骨髓基质干细胞；髋关节；软骨缺损；组织工程

关节软骨损伤修复是骨科学研究的热点，组织工程技术的出现为关节软骨损伤的治疗提供新思路。目前常用的研究方法为在体外培养扩增种子细胞，在体外与生物材料结合后直接植入体内修复关节软骨缺损[1]。我们通过组织工程技术在体外构建组织工程软骨，并应用于修复兔股骨头关节软骨损伤，现报告如下。

1 材料与方法

1．1 实验动物 3月龄健康新西兰大白兔16只，雌雄对半，体质量2．1～3．4 kg，购自上海中科院实验动物中心。

1．2 主要实验仪器和试剂 CO2培养箱（HERA），超净工作台（苏州净化设备厂），倒置显微镜（Olympus），DMEM培养液、0．25%胰蛋白酶、细胞因子TGF-β、b-FGF（Sigma），小牛血清（杭州四季青生物公司），Ⅱ型胶原免疫组化试剂盒（北京中杉生物公司），RNA提取试剂盒（QIA），RT-PCR试剂盒（晶美生物公司），组织细胞染色（本院病理科提供），生物材料胶原膜由中科院生物医学工程研究院提供。

1．3 实验方法

1．3．1 骨髓基质干细胞的获取 可取自两侧髂棘，用16号骨髓穿刺针抽取骨髓2 ml，针筒内预先置入1 ml DMEM培养液（含肝素1 000 U），以3∶7的比例加入淋巴细胞分离液，以2 000 r/min，15 min离心，吸取中间单个核细胞层，再用DMEM培养液冲洗3次，血球计数板计数。

1．3．2 骨髓基质干细胞培养 按15×105/ml细胞浓度培养，培养液DMEM培养基含小牛血清12%、青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml，培养条件为5%CO2、37℃、饱和湿度，培养3 d后更换所有培养液，以后隔天换液1次至细胞单层融合，应用0．25%胰酶消化获得第一代骨髓基质干细胞用于诱导分化实验。

1．3．3 骨髓基质干细胞诱导分化 取上述细胞，加入含25 ng/ml TGF-β、2 ng/ml b-FGF和12%小牛血清的DMEM诱导分化培养液，2 d换液1次，7 d传代1次，获取第3代细胞作为本研究实验细胞。

1．3．4 体外组织工程化软骨的构建 取上述细胞悬液进行浓缩，密度为2．5×107/ml，滴注到胶原膜上，4 h后缓慢加入诱导分化培养液，3 d半量换液1次，维持培养2周后用于检测及体内实验。

1．3．5 体外构建组织工程软骨特性检测 取上述构建的组织工程软骨福尔马林固定、石腊包埋、切片，HE染色，阿新兰染色，RT-PCR进行Ⅱ型胶原基因表达检测。

1．3．6 股骨头关节软骨缺损模型制作与组织工程修复 1%戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉，常规消毒铺巾，取兔髋关节外侧纵形切口，切开髋关节外侧肌群，暴露髋关节关节囊，“T”切开关节囊，手法致髋关节脱位，暴露股骨头，用环钻人为造成股骨头负重区直径约3 mm、深约3 mm关节软骨缺损，取上述构建的组织工程软骨，交替植入一侧软骨缺损区为实验组，相应的另一侧不作任何处理为空白对照组或单纯用胶原膜修复为材料（实验组16个缺损，空白对照8个缺损，材料对照8个缺损）。手法复位，认真缝合髋关节关节囊及各层组织，术后让动物自由活动，于8、16周后处死动物，取髋关节软骨缺损修复情况。

1．3．7 组织学检查 取修复组织福尔马林固定后，脱钙后石腊包埋、切片、HE染色，Ⅱ型胶原免疫组化染色，观察修复结果。

2 结果

2．1 骨髓基质干细胞分离与培养 分离的细胞在培养第2天开始出现细胞贴壁生长，呈纺缍形、多角形、短梭形，细胞增殖旺盛，8 d后长满培养瓶，在倒置显微镜下细胞形态一致。

2．2 组织工程化软骨的特性 经诱导分化培养2周后胶原膜与细胞复合体体积变化不明显，质地仍较软。HE染色显示复合体内细胞呈梭形，未见明显软骨陷窝，RT-PCR可检测出Ⅱ型胶原基因有较强的阳性表达，阿新兰染色显示细胞周围基质强阳性着色。

2．3 大体标本 术后全部动物自主活动良好，伤口愈合好，未见明显感染,术后8周取大体标本观察，见修复组股骨头负重区关节软骨缺损处有白色软骨样组织修复，缺损填充平整；术后16周关节软骨缺损仍为白色软骨样组织修复，部分见表面粗糙；两对照组未见修复，见明显关节软骨缺损区。

2．4 组织学观察 术后8周HE染色片光镜下见修复组修复组织为透明软骨样组织，厚度接近正常，与周围软骨面结合好，表层细胞为梭形成纤维样软骨细胞，中下层以圆形透明软骨样细胞为主，可见呈柱状排列，与软骨表面相垂直，软骨陷窝清晰可见，与底层软骨下骨连接良好；术后16周软骨陷窝仍清晰，但镜下可见软骨细胞排列紊乱。对照组为明显缺损区，部分为纤维样组织修复。

2．5 组织化学染色与免疫组织化学染色 对修复组织切片后进行阿新兰染色，见细胞周围基质被染成深蓝色，Ⅱ型胶原免疫组化染色显示修复组织中细胞的细胞质和细胞外基质Ⅱ型胶原强阳性表达；对照组纤维样组织Ⅱ型胶原免疫组化染色阴性。

3 讨论

关节软骨组织工程构建的基本原理是在体外培养扩增获得大量软骨细胞，与可吸收材料结合塑形后植入体内代替损伤的软骨组织，近年来的研究发现软骨细胞在体外扩增极易产生去分化现象，从而失去软骨细胞表型，不是理想的种子细胞[2]。

骨髓基质干细胞是一种多能干细胞，已证实其在特定条件下可诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞甚至神经元细胞，但是在骨髓中骨髓基质干细胞的含量极低，需要大量的骨髓才能获得足够细胞量[3]。而且我们前期的实验已证实经过大量传代后骨髓基质干细胞仍保持分化成软骨潜能，应用含25 ng/ml TGF-β、2 ng/ml b-FGF和12%小牛血清的DMEM培养液可将骨髓基质干细胞成功诱导分化为软骨样细胞[4]。

细胞在体外培养时易产生接触抑制从而影响细胞的生长和功能，本研究中应用的多孔胶原膜可以为骨髓基质干细胞提供生长和增殖空间，有利于细胞的营养摄取和物质交换，阿新兰染色和基因检测显示所构建的组织有特异性Ⅱ型胶原和酸性粘多糖（GAG）表达，符合软骨组织特性。本研究结果显示在修复后8周关节软骨缺损修复良好，但16周后部分关节出现不同程度的退行性改变，其可能的原因是骨髓基质干细胞在体外的诱导培养时间过长，从而失去干细胞的某些特性，改善培养环境及条件是继续研究的方向。

参考文献

1 陈雷,杨志明,林建华，等.组织工程软骨对兔膝关节胫骨平台浅层全关节软骨缺损的修复作用.中华实验外科杂志，2006,23(8):982-984.

2 杨柳,段小军,戴刚,等.人间充质干细胞体外成骨诱导培养及其生物学特性变化.第三军医大学学报,2002,24（2）:509-512.

干细胞培养技术篇(6)

【关键词】 小鼠; 胚胎发育; 微分干涉差显微术

ABSTRACT: Objective To observe systematically and set up the atlas of the whole developmental process of mouse preimplantation embryonic oocyte with differential interference contrast(DIC) microscopy(DIC). Methods Mouse oocytes and preimplantation embryos were derived from in vitro or in vivo fertilization. The full developmental stages from preovulatory oocyte to expanded blastocyst of mouse embryos were observed by inverted DIC microscope， and photos were taken by digital microphotography. Results A DIC atlas of preimplantation embryos in full developmental stages was formed from preovulatory oocyte to expanded blastocyst. Conclusion DIC technique offered a stereo and fine image of cell/embryo in different stages. The atlas made from this observation can be used for reference to those who needs to culture and manipulate mouse embryos.

KEY WORDS: mice; embryonic development; differential intereference constrast microscopy

随着功能基因组学时代的到来，转基因小鼠、基因打靶(尤其是其中的基因敲除)小鼠、克隆小鼠技术和小鼠胚胎干细胞工程等，已经成为生命科学各前沿领域普遍采用的研究手段。在这些研究中，使用微分干涉差显微镜(differential interference contrast microscope，DIC)技术，对小鼠的早期胚进行细致的观察与操作是不可或缺的关键步骤［1］。笔者对小鼠体内发育或体外受精形成的早期胚各个阶段，用DIC显微镜进行系统观察并实时摄影，形成小鼠早期胚发育全过程图谱，为推广小鼠胚胎操作技术，促进基因功能研究提供实用的基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

SPF级ICR小鼠，3周龄雌鼠，体质量15~18 g;性成熟雌鼠、雄鼠，体质量30~35 g［上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号:SCXK(沪)2003-0003］，雌鼠52只，雄鼠12只。

1.1.2 主要试剂

孕马血清（PMSG 1 000 IU/瓶，杭州动物药品厂);人绒毛膜促性腺激素（hCG 1 000 IU/瓶），丽珠集团丽珠制药厂);M2培养基、M16培养基:参照文献［1］配制;KSOM＋AA培养基［2］(EmbryoMax，美国Chemicon公司);矿物油(Embryo Culture Tested，M-8410，美国Sigma公司)。

1.1.3 主要仪器

倒置显微操作系统(TE-2000U型，日本Nikon公司);数码显微摄影系统(DP-70型，日本Olympus公司);三气培养箱(3131型，美国Thermo公司);体视显微镜(SZX7型，日本Olympus公司);双人单面净化工作台(SW-CJ-1Cu型，苏州净化设备有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠超数排卵

选用3周或性成熟ICR雌鼠为供卵/胚鼠。用于体外受精的小鼠于第1天17-18时腹腔注射PMSG 5.0 IU，48 h后腹腔注射hCG 5.0 IU，待用;用于体内受精的ICR雌鼠于第1天12时左右腹腔注射PMSG 5.0 IU，48 h后腹腔注射hCG 5.0 IU，熄灯(20时)前与性成熟雄鼠合笼，自然交配，第4天8时左右检查雌鼠，选有阴道栓者待用。

1.2.2 排卵前卵母细胞采集与处理

选取经超数排卵后而未受精的雌鼠，断颈处死，从腰背部打开腹腔，取出卵巢，在M2培养液中用解剖针刺破卵巢上突出的卵泡，释放卵泡内的卵丘团，用20 μL移液器吹吸，洗净组织碎片;收集卵丘团，用自制的玻璃微吸管(D≈120~160 μm)反复吹吸，去除卵丘颗粒细胞;置于体积分数为0.05的CO2、37 ℃预平衡的KSOM液滴中，覆盖石蜡油，立即观察。

1.2.3 体内受精小鼠早期胚采集与培养

于第4天10时左右(合笼交配0.5 d)采集体内受精的受精卵。选取超数排卵并合笼后有阴道栓的雌鼠，断颈处死，打开腹腔，取出输卵管和卵巢，剔除血管和脂肪，在M2培养液中刺穿输卵管壶腹部，挑出卵丘团，以0.1%透明质酸酶消解卵丘细胞，M2洗涤3遍以上，将卵子分成两份:一份直接进行DIC观察;另一份转移至预平衡的KSOM中培养(CO2、温度条件同1.2.2)。

1.2.4 体内受精小鼠桑椹胚和囊胚采集与培养

于第4天10时前选取超数排卵并合笼后有阴道栓的雌鼠，做好标记，继续饲养;第7天10时左右(合笼交配3.5 d)采集体内受精的桑椹胚和囊胚。小鼠断颈处死，打开腹腔，取出子宫和输卵管，用装有M2培养液的1 mL注射器刺穿子宫与输卵管结合部，冲出子宫内的早期胚，M2洗涤3遍以上，转移于预平衡的KSOM中培养(CO2、温度条件同1.2.2)。

1.2.5 体外受精和早期胚培养

第4天8~9时在培养皿中做哑铃型M16液滴0.5~1 mL，覆盖石蜡油，体积分数为0.05的CO2平衡≥15 min;将性成熟雄鼠附睾尾(剔除血管与脂肪)剪碎，放入液滴一侧，体积分数为0.05的CO2、37 ℃培养5~10 min;从哑铃型液滴另一侧吸出运动良好的精子悬液适量，调节精子密度为(5~10)×105/mL，置于培养皿中形成50~100 μL小滴，覆盖石蜡油获能培养1~2 h(CO2、温度条件同1.2.2)。

第4天10时左右，将经超数排卵的雌鼠断颈处死，打开腹腔，取出输卵管和卵巢，剔除血管和脂肪，在M2培养液中刺穿输卵管腹壶部，挑出卵丘团(方法同1.2.3)。吸取卵丘团在M16液滴中清洗两次，加入到精子悬液小滴中，体积分数为0.05的CO2、37 ℃授精培养;于授精培养的不同时间将卵子吸出，观察精卵相互作用情况;拟作早期胚培养者于授精培养5~6 h后，将卵子吸出在M16液滴中洗涤掉多余的卵丘细胞和精子，并将受精卵分成两份:一份直接观察受精结果;另一份移入KSOM液滴中进行早期胚培养(CO2、温度条件同1.2.2)。

1.2.6 微分干涉差显微观察

用口吸管将卵子或胚胎移入玻璃培养板上，石蜡油覆盖液滴，置于倒置DIC显微镜下观察。4×物镜寻找目标，20×或40×物镜观察;调节起偏器、检偏器、光圈和聚光器高度至恰当位置，观察图像呈灰色调、图像浮雕感和反差适中为度。采用数码显微摄影系统进行摄影，所有照片均于20×物镜下拍照。

精子与透明带的相互作用在体外受精实验进行授精培养2 h左右，在倒置显微镜下检查，见卵丘颗粒细胞完全散开，透明带暴露明显时即将卵子吸出，吹吸数次，除去粘附精子，以4%甲醛固定至精子制动后置于DIC显微镜观察;体外受精结果的检查，从移入KSOM时，即授精培养6 h(hCG后23~24 h)起观察单细胞受精卵;排卵前卵母细胞或体内受精的早期胚，从解剖获取细胞/胚胎起观察，此后于连续实验过程的每天上午、下午和晚上各观察1~2次，每次30~90 min，记录观察/拍照时间并分别计算图像距hCG注射或受精的时程。

2 结 果

DIC显微镜观察卵母细胞和各阶段早期胚，见细胞形态呈浮雕状的立体图像，各种结构边界清晰、细节明显，对比度适当，可以准确生动地显示如细胞与细胞核的边界、细胞质内的细胞器颗粒、细胞核内的核仁、染色质颗粒等微细结构。

本研究分8个阶段连续观察早期胚形成与发育的全过程，包括:(1)排卵前卵母细胞；(2)排卵后卵母细胞；(3)受精；(4)受精卵；(5)二细胞胚；(6)四细胞胚；(7)八细胞-桑椹胚；(8)囊胚。每个阶段分别观察≥50个目标，选取有代表性的各阶段细胞/胚胎摄影图像并依据时间次序排列，构成图谱。卵母细胞和各阶段胚胎形态的DIC显微图谱见图1。依照从卵母细胞成熟至囊胚扩展的次序，对卵母细胞成熟和早期胚发育全过程的形态特点概要描述如下。

小鼠卵巢排卵前卵泡中挑取的未成熟卵母细胞，可见卵母细胞肥大，紧贴透明带，细胞质内充满细小的颗粒状物质(简称胞质颗粒);细胞核(生发泡)大而圆，核膜边缘清晰，核内可见核仁及多个染色质颗粒［图1-(1~3)］;部分卵母细胞的生发泡转移靠近细胞表面，胞质颗粒变粗并呈聚集状态，提示细胞骨架发生重组［图1-(3)］。图1-(4~6)为排卵前的成熟卵母细胞，［图1-(4)］示生发泡破裂，胞质颗粒进一步增粗;部分卵母细胞胞质局部呈山丘状突出［图1-(5)］，并排出形成第一极体，胞质颗粒恢复为细小状态［图1-(6)］。排卵后从输卵管壶腹部挑取的卵母细胞与排卵前的成熟卵母细胞在形态上并无显著差别［图1-(7~8)］，细胞质内紧靠极体或附近区域可见纺锤体［图1-(7~8)］，纺锤体处胞质颗粒极少或缺乏。体外受精时，大量精子附着于透明带上，可见卵母细胞因甲醛固定而缩小［图1-(9)］，个别精子穿透透明带［图1-(10~11)］;可见单个精子头部已经穿过卵母细胞膜，并在卵母细胞表层胞质中形成核膨胀［图1-(10~11)］，该处卵母细胞胞质呈锥体状突出成为“受精锥”［图1-(10~11)］;部分卵母细胞在精子核膨胀时即排出第二极体［图1-(11)］。受精后卵母细胞内雌、雄原核形成，早期两原核相距较远，第二极体与第一极体并拢［图1-(12)］;双原核逐渐向受精卵中央迁移［图1-(13)］，并相互靠拢［图1-(14)］，两原核逐渐融合为1个［图1-(14~15)］，核膜清晰，多个核仁清晰可见，细胞体积有所增大，表明原核迁移过程中已经开始进行DNA复制和蛋白质合成，为下一步的卵裂做准备。原核融合后细胞核一分为二［图1-(15~16)］细胞变为多边形并逐渐拉长［图1-(16~17)］，细胞核向两极迁移、细胞中央凹陷，形成“腰”

［图1-(18~19)］; 卵“腰”进一步凹陷，细胞一分为二，形成大小相等的2细胞卵裂球［图1-(20~21)］。随后，2细胞卵裂球(也称二细胞胚)内细胞核一分为二，并出现极化分布［如图1-(22~23)。长形的2细胞胚相互旋转并再次卵裂形成4细胞胚［图1-(23~26)］;继而进一步卵裂形成6细胞胚［图1-(27)］、8细胞胚［图1-(28)］、桑椹胚［12~16细胞，图1-(29)］。从8细胞胚开始，细胞之间排列十分紧密，相邻两细胞表面紧贴［图1-(28~29)］。随着胚继续培养，多细胞的桑椹胚内部已难以分辨细胞边界，即所谓致密化［图1-(30~31)］。桑椹胚后期，在胚内部局部出现小的腔隙即胚泡腔，演变为囊胚(亦称胚泡，图1-32);胚泡腔逐渐扩大，部分早期胚细胞形成单层扁平的胚泡壁(滋养层)，另一部分细胞位于胚泡腔一侧，形成内细胞团［图1-(33)］;继续培养，内细胞团的细胞数量增多、体积变小，胚泡腔逐步扩大，胚胎体积增大，透明带变薄［图1-(33~34)］，在充分扩展的晚期囊胚，胚泡壁细胞间结合部特别薄［图1-(35)］，此处是做嵌合体动物时ES细胞囊胚注射的最适合位点。

3 讨 论

近年来，对小鼠早期胚进行观察、培养和操作，已经超越了传统的生殖生物学和发育生物学专业而成为生命科学众多领域中普遍应用的技术。因此，一个早期胚发育全过程系统观察的图谱，对推广、普及这些技术的应用不仅具有重要的实用价值而且具有较强的紧迫性。

3.1 DIC显微术的优点

传统对早期胚发育过程形态变化的认识，来源于利用相差显微镜所进行的观察［1］。由于相差显微镜技术存在着图像不够细致、边缘效应即“光晕”显著的固有缺点，使其不能观察细胞内部和边缘的细节，从而难以适应大多数显微操作的需要，故当前对细胞和胚胎进行显微操作时普遍使用更先进的DIC，尤其是在进行基因原核注射、细胞核移植和胞质内精子注射等实验中，DIC成为不可替代的工具［1］。因此，用DIC观察小鼠早期胚发育形态成为胚胎操作实验中的基本功。然而，迄今尚未见利用DIC对小鼠早期胚发育全过程进行系统观察的报道及其相应图谱，不利于胚胎操作技术的推广。DIC是在相差显微镜基础上改进的新一代活细胞观察技术。利用DIC观察细胞与胚胎，细胞形态呈浮雕状的三维图像，细胞内外各种结构边界清晰、细节明显、对比度适当，尤其是其聚焦深度较狭窄，通过调节焦距可以获得细胞不同层面的图像［如图1-(1~2)］，即对细胞进行光学切片，可以准确、生动地显示如细胞与细胞核的边界、细胞质内的细胞器颗粒、细胞核内的核仁、染色质颗粒等微细结构。目前，DIC已全面应用于对活细胞的观察，并可与其他光学显微技术相结合进行细胞/胚胎的生理功能、染色体运动和分子活动的分析［3-5］。因此，利用DIC来观察胚胎发育过程，可以更准确、精确地了解胚胎的发育状态并便于对其进行细致的显微操作。本研究采用DIC显微术，全面系统地观察从卵母细胞成熟至囊胚扩展的早期胚发育全过程，观察时间点密集，观察样本量大，各阶段标本图像的重现率极高，对一些连续变化过程，如原核迁移、卵裂经过等做了连续追踪并对各阶段的形态特征与胚胎发育时相做了较精确的对应。对一些不易观察的微细的细胞内结构，如成熟卵母细胞纺锤体和穿入卵母细胞的精子，本研究也拍摄了明确清晰的图像。因此本研究形成的图谱可借鉴性强，为推广胚胎培养和胚胎操作技术提供了有价值的实验资料和技术依据。

3.2 DIC操作要点

运用DIC技术应注意以下操作要点:(1)DIC的光学特性与玻璃载体(如载玻片、玻璃培养皿等)相匹配，而常规使用的塑料细胞/胚胎培养皿，在DIC观察时易产生入射光的折射而出现颜色变化，降低图像的清晰度和立体感，影响摄影效果。故采用塑料培养皿培养细胞/胚胎时一般只适于进行实时检查，要进行精确观察和摄影时，应将标本转移至玻璃载体上观察。同时，在使用恒温载物台时，要避免采用以塑料为材料的恒温板。(2)DIC具有光染色效果，可调出不同彩色图像，但以灰色调图像的立体感和对比度最强。在灰色调下适宜观察细胞内的微细结构及其差别。因此在做精细观察和显微操作时宜采用此色调。(3)DIC具有光学切片效果，对卵母细胞和早期胚这类较大的目标可通过调节显微镜焦距获得不同层面的清晰图像。在对不同目标进行尺寸比较(例如卵母细胞或胚胎直径)时要注意采用同一层面的焦距进行观察，例如在比较不同胚胎的大小时可采用最大直径的层面进行观察。(4)在转换标本或者视野时应注意观察图像效果的变化，必要时可通过细致调节起偏器、检偏器、聚光器光圈达到最佳效果。

【参考文献】

［1］Nagy A，Gertsenstein M，Vintersten K，et al. Manipulating the mouse embryo: a laboratatory manual［M］. 3th Ed. New York:Cold Spring Harbor Lab Press， 2003:714，179-185，31-61.

［2］黄吴键，袁 进，邓 星，等. KSOM培养基营养成分调整对小鼠植入前期胚体外发育的影响［J］. 第一军医大学学报， 2005，25(3):256-261.

［3］Warger W C，Laevsky G S，Townsend D J，et al. Multimodal optical microscope for detecting viability of mouse embryos in vitro［J］. J Biomed Optics， 2007，12(4):44006-44012.

［4］Otsuki J，Nagai Y. A phase of chromosome aggregation during meiosis in human oocytes［J］. Reprod Biomed Online， 2007，15(2):191-197.

干细胞培养技术篇(7)

【关键词】细胞培养室；技术服务与交流；培养室建设与管理

实验室是高等学校从事科研的重要基地，营造一个好的实验研究环境对实验室管理和建设起着至关重要的作用。实验室管理质量的好坏，直接关系到实验研究是否进展顺利。良好的实验室建设，能给研究者带来愉快的心情，同时也能有效的提高研究质量。

细胞培养室是综合实验室的一个重要组成部分, 细胞培养技术是生命科学各研究领域的一种最基本、最重要、也是应用最广泛的研究技术之一。对于高等医学院校来说,各生物医学相关学科均建有细胞培养实验室，其规模、档次、技术水平、使用效率、管理模式、服务保障等方面都缺乏统一的标准，普遍存在着小而全、投资分散、资金浪费、缺乏有效管理、无法提供服务保障、不利于技术交流和创新等诸多问题。本文总结了笔者在细胞实验室管理与建设方面的一些经验，并与广大同行进行探讨。

1 细胞培养室的服务职能

细胞培养除了需要娴熟的操作技术外，更多的体现在培养技术的过程复杂，无菌要求严格。研究人员掌握该门技术的时间周期较长。如果成天陷入清洗，包装和消毒等简单繁琐的劳动中，就会影响研究人员专心致志地从事研究活动中更重要的环节。建立大型细胞培养室，由专人进行工作流程服务，实验室按研究人员的要求提供标准化、规范化的实验用品和材料，可以极大地提高细胞培养实验室的成功率，确保实验器材符合细胞培养的要求，减少研究人员的无谓劳动。因此可以将研究人员从烦琐的劳动中解放出来，安心从事更重要的研究活动。

2 细胞培养实验室的技术交流

细胞培养是一项通用的技术平台。但针对各个研究课题而言，每个研究人员进行细胞培养的目的和要求又各不相同，即既有共性，又有特殊性。一个学科自建的细胞培养室，一般仅局限于本学科领域内有限的研究方向所必需的细胞培养方法和技术，对其它的特殊方法了解不多，因此不利于技术创新。即便是某个研究生掌握的新方法，常常由于毕业分配等原因离开科室，而使新的特殊技术不复存在，不利于特殊技术的建立和完善。

如果大型细胞培养室面向全校开放，自学科的研究人员中具有丰富科研经验的研究人员、博士、硕士等不同层次、不同研究目的和不同要求，他们相互之间不存在利害关系，容易交流，毫无技术保留。每个人的经验和教训很快为大家所用，可极大缩短技术学习的周期和提高新技术的交流。同时，实验室建立了技术档案制度，不同学科的研究人员探索的新技术不会因走人而流失，可以极大地丰富和积累特殊技术，提高技术水平，为后来者提供更多的方便。

3 细胞培养室的建设

3．1 细胞培养室面积和房间安排 实验室的面积应由实验台的长度、净化工作台的大小等仪器设备情况决定，同时还应考虑科研及实验人员有足够的空间，以便安全地进行科研及实验活动。此外,还应设置面积不小于6 m2的缓冲间及与工作分开的更衣柜等。如果细胞培养室面积大于一个标准单元，至少应有两个出口，以随时保持畅通。细胞室里的试验台和仪器布局应合理。一般来说，二氧化碳培养箱和净化工台不应对着门摆放，离心机不应离得太远。

3．2 培养室的环境和设施 ① 照明以不影响对实验中产生的各种现象的观察为基准，一般采用荧光灯。宜设置专门电力变压器供电,提高供电质量和可靠性；②房间装修密闭性应较高，且不宜开设外窗，设窗主要为采光好，必要时还应安装空调。门、窗、墙表面应涂布便于清洗去污和耐腐蚀的材料。由于细胞原代培养要求较高，设置空气净化装置；③对于配制有毒的试剂，产生较大的气味和有害气体的实验应在规范的通风柜中操作。操作有放射性同位素的实验,应配备个人防护用品和淋浴室,其废液应妥善处理。

4 细胞培养室管理制度的建立

4．1 消毒清洁制度 ①每个进入细胞室的工作人员应保证其个人卫生；②进入缓冲间时,应更换洁净的工作服和拖鞋,进入培养室时须戴帽子和口罩。如做原代培养,工作服应消毒；③第一个进入培养室的人员请及时开启空气净化装置,最后离开人员请关闭空气净化装置；④每天实验前必须紫外线常规消毒1 h。每周一次卫生消毒工作并做空气细菌培养检查。每月一次全面清洁工作。

4．2 培养箱的使用 ①每天观察二氧化碳压力表,及时更换二氧化碳钢瓶。同时观察二氧化碳流量指示表,同时培养箱内应放置一温度计,记录其温度与指示表温度是否一致；②培养箱应划分不同区域，不同细胞应放不同区域，同时保持适当的湿度；③有的培养箱有高温消毒功能，注意非管理人员不要动此功能键，以免造成某些元件烧毁。

4．3 洁净工作台的使用 ①使用前1 h应紫外线照射；②洁净台内也应划分不同的区域，如材料区、操作区、污物区等；③注意安全，特别是酒精灯，如有酒精漏出应立即吸干擦净，如发生意外用纱布、棉布类盖灭酒精灯；④ 实验完毕,所用过的器皿、杂物必须清理,同时进行台面清洁。

4．4 液氮瓶和低温冰箱的管理 ①定期检查液氮的容量，并做好记录；②存、取细胞株时，注意防冻安全；③存放细胞株时，根据其种类不同，放置不同盒内，同时应标记好名称和时间并记录；④低温冰箱使用时应按其种类划分不同区域，做好标记并记录。

4．5 实验室资料管理制度 ①收集课题计划书、实验路线、操作步骤、操作记录，各种实验的数据及仪器说明书等；②由负责人指定专人负责并督促不同时段内完成。如果有不规范的资料，请有关人员及时纠正；③资料归档后的资料由专人统一管理。若有些课题涉及专利与发明等知识产权问题，应注意保密。

总之,随着现代科学技术的快速发展,适应高等医学院校科研要求,如何建设好和管理好大型细胞培养实验室对于促进学校科学研究水平的提升是值得探讨的课题。

参考文献

［1］ 张远方. 高校合并后实验室管理模式的探讨. 实验室研究与探索，2003，22（1）：118-120.

［2］ 崔冬生，李增宁，顾平，等. 细胞培养室管理规则. 华北煤炭医学院学报，2004，6（3）：395-396.

［3］ 陈乃清，宋平，李晓迎，等. 改革细胞生物学实验教学,提高学生综合素质. 实验技术与管理，2002，19（2）:8-11.