基因组学方法篇(1)

关键词:食品安全检测;蛋白组学;代谢组学;基因组学

1前言

民以食为天,食以安为先。食品安全关系人类健康,一直以来,都是全球关注的热点。随着社会经济的发展,一方面,随着生活水平不断提高,公众对食品安全越来越重视,要求也越来越高;另一方面食品工业快速发展,国际食品贸易日趋频繁,食品安全问题已呈现全球化模式。威胁食品安全的因素不仅仅有传统的化学危害物、食源性致病菌;采用劣质原料生产高货值食品、以次充好、以假乱真、产地造假、成分造假等等问题,是目前食品安全面临的新挑战。目前,已知危害物的检验技术已经比较成熟;未知、潜在的食品安全危害物侦别及成分鉴定、产地鉴定等,是食品安全检测技术面临的难题。食品安全检测迫切需要新的方法和手段来解决这些难题和挑战。组学是最近几十年发展起来的新学科,主要包括基因组学(Genomics)、蛋白组学(Proteinomics)、代谢组学(Metabolomics)、转录组学(Transcriptomics)、脂质组学(Lipidomics)、糖组学(Glycomics)等等。其中,基因组学、转录组学、蛋白组学和代谢组学共同构成了“系统生物学”[1-2]。组学技术的基本思路是通过研究成千上万的DNA、RNA、蛋白质或者代谢物等物质,找出与某一生命过程相关的特征蛋白、DNA、RNA或者代谢物,进而对某一目标进行评估。组学技术依托高通量、高分辨率、高精度的现代化分析仪器,通过海量数据处理,进行信息提取和结果分析。近年来,组学技术与食品安全检测不断融合,在食品安全检测领域发挥着越来越重要的作用。

2与食品安全检测相关的组学技术

2.1蛋白组学。蛋白组学研究特定状态下蛋白整体水平的存在状态和活动规律,是从分子水平上来分析蛋白质的表达、修饰、功能等的一门学科。蛋白组学的研究对象涉及植物、动物、微生物等,其在药物开发、病理研究、食品安全等方向都有诸多应用。蛋白质可以作为食品组分的特征标记物,因此蛋白组学可以用于食品安全检测[3]。蛋白组学的研究手段主要有凝胶技术和质谱技术,质谱可以对肽段和蛋白进行表征和测序,是分析蛋白的重要技术。通过蛋白酶解后得到肽段的肽指纹图谱结合质谱技术,可以分析某一种或同类食物的蛋白质成分[4],经过比较和筛选,确定特征标志蛋白或者肽。基于对蛋白或者肽的分析,质谱技术可以获得食品组分的特定指纹信息,实现定性分析。一旦获得蛋白标志物或者肽标志物,即可用液相色谱-质谱的选择反应监测(SRM)或者多反应监测(MRM)模式对目标物进行快速、灵敏的定量分析检测。2.2代谢组学。代谢组学以生命体的代谢物为研究对象,主要研究分子量1000以下的小分子[5-6]。根据研究对象不同,代谢组学可以分为研究已知化合物的靶向代谢组学和分析未知化合物非靶向代谢组学。代谢组学作为新兴的研究技术已应用在食品安全、药物研发、疾病诊断、环境科学和植物育种等方面[7]。代谢组学的主要研究手段包括核磁共振技术(NMR)和质谱技术。质谱技术以高通量、高灵敏度著称,飞行时间质谱和高分辨质谱是代谢组学研究中经常用到的仪器;NMR技术具有非破坏性的优点,可以对研究对象内部化学变化和生化反应进行跟踪[8-9]。常见的代谢物主要有极性化合物(例如有机酸、氨基酸、糖、胺)、脂类、类萜和固醇。代谢组学分析得到的数据量巨大,需要借助化学计量学对数据进行分析处理,常用的分析方法包括主成分分析(PrincipalComponentsAnalysis,PCA)、判别分析(DiscriminantAanalysis,DA)、偏最小二乘法-判别分析(PartialLastSuares-DiscriminantAeqnalysis,PLS-DA)等方法[10]。2.3基因组学。基因组学的研究对象包括基因组的结构、功能、进化、定位、编辑等,以及他们对生物体的影响。基因组学通过使用高通量DNA测序和生物信息学来组装和分析整个基因组的功能和结构。近几十年来,多重聚合酶链式反应、基因测序、基因芯片等技术飞速发展,为基因组学在食品安全领域的应用打下了良好的基础。基于基因组学特异性强、灵敏度高和高通量的特点,其在病原微生物检测,物种鉴定和转基因食品检测方面有着很多应用[11-12]。

3组学技术在食品安全检测中的应用

3.1食品中有害物质检测。食品中不含危害人类健康成分是食品安全的最基本要求。组学技术在检测食品中有害物质方面有着广泛的应用。随着生活水平的提高,动物源性食品的需求量快速增加。经济利益驱使下,为了规避食品安全法规中已有兽药的使用限制,使用新兽药的情况时有发生。传统方法只针对目标化合物进行检测,对于非目标化合物即新型兽药的检测无能为力。采用组学方法,寻找合适的生物标志物,可以及时发现新型兽药的使用情况。Courant等[13]采用液相色谱-高分辨质谱和非靶向代谢组学技术,建立了监测小牛尿液中β2-受体激动剂代谢物的方法,有望成为筛查各类β2-受体激动剂兽药的有效方法。Regal等[14]应用代谢组学技术结合高效液相色谱-高分辨质谱结合多元变量统计分析,找出了牛血清中外源性雌二醇和孕酮的生物标志物,为检测动物养殖过程中的激素滥用提供了新方法。发酵食品中含有丰富的微生物和各种有益消化酶,具有独特的风味和较高的营养价值,深受大众喜爱。生物胺和亚硝酸盐是食品发酵过程中常见的两类有害物质。生物胺包括芳香胺(酪胺、苯乙胺、多巴胺等)、脂肪胺(腐胺、精胺、亚精胺等)和杂环胺(组胺、色胺等),主要来源于发酵过程中的微生物降解。亚硝酸盐是发酵食品中重要的危害物质;发酵过程中,微生物分泌硝酸盐还原酶将硝酸盐还原产生亚硝酸盐。Meyer等[15]利用液相色谱法和主成分分析相结合的代谢组学方法,研究了发酵香肠中的生物胺和亚硝酸盐含量。用该方法对101个样品进行检测,发现其中NaNO2的浓度均低于20mg/kg,生物胺含量普遍很低,仅在一个样品中发现尸胺和腐胺浓度达到了中毒水平。3.2组学技术在食源性致病菌检测中的应用。食源性致病菌是食品安全面临的最严峻挑战之一,传统检测方法从细菌培养到细菌计数,检测一个样品至少需要4~5d的时间,而组学技术可大大提高食源性致病菌检测的效率。代谢组学在沙门氏菌和大肠杆菌的鉴定方面已经取得一定成果[16-18]。Xu等[16]利用气相色谱-质谱法和一种多元算法进行了鼠伤寒沙门氏菌污染猪肉和自然变质猪肉中代谢物的分析,确定了17种代谢产物(包括各种类型的氨基酸和脂肪酸),以区分被致病微生物污染的猪肉。Cevallos等[18]建立了基于代谢组学检测大肠杆菌O157∶H7、沙门氏菌的方法,根据对细菌代谢物的分析,此方法可以在18h内快速检测以上两种病原体,在牛肉和鸡肉中大肠杆菌O157∶H7、沙门氏菌检测水平均可以达到7±2CFU/25g。Whiteside等[19]给出了大肠杆菌的在线基因组学预测平台SuperPhy,该平台整合了所有可以公开获得的大肠杆菌基因组分析工具和基因组序列数据,可以用于临床医学、流行病学、生态学和进化领域等领域,亦可应用于食品安全检测领域。祝儒刚等[20]运用多重聚合酶链式反应结合基因芯片技术,建立了一种检测大肠埃希氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和单核细胞增生李斯特菌5种食源性致病菌的方法,该方法快速、准确、灵敏。全基因组测序(WholeGenomeSequencing,WGS)广泛应用于食源性致病菌特征分析,在确定污染事件根源、食品安全事件溯源、食品安全突发事件检测和鉴定,以及毒力和致病性特征分析方面,WGS技术发挥着越来越重要的作用[21-22]。3.3食品掺假及欺诈的研究。食品掺假、欺诈是世界性问题[23]。据估算,全球食品行业每年由于食品掺假和欺诈带来的经济损失高达150亿美元[24]。当前,与食品掺假相关的议题包括产地、品种、生产方式、未宣布成分、物种替代等[25]。有关食物的完整、准确和真实的信息不仅是消费者的迫切需求,也是行业和政府的迫切需求。运用组学技术对食品进行检测,可以确保食品从农场到餐桌的真实性。与传统检测方法项目比,组学技术在检测食品掺假和欺诈方面具有天然优势。通过高通量的检测模式,对样品中的蛋白质、代谢物或者DNA进行检测,通过对大量数据的统计处理、甄别食品特性,进而可以确定食品产地、品种、成分、物种及生产方式等诸多与食品掺假相关的要素。运用特征标记肽段可以检测马肉、牛肉、羊肉和猪肉[26]。MontowskaFornal[27]采用液相色谱-串联质谱方法,选择了20个热稳定肽段,可以有效区分猪肉、牛肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉,在实际样品检测中,从禽肉肠中检出含量仅为0.8%的牛肉成分。基于气相色谱技术,运用代谢组学分析方法可以有效区别冷冻猪肉和新鲜猪肉[28]。乳品行业中,牛乳冒充羊乳,奶粉调制的复原乳冒充鲜奶,工业化生产的奶酪冒充手工奶酪的欺诈行为极其常见。Caira等[29]应用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行分析,根据酪蛋白的特征肽可以有效鉴别水牛乳、牛乳、牛初乳和乳酪。一种结合肽和蛋白质谱的方法可以有效检测水牛乳、羊乳中的牛乳,判断鲜牛奶中是否加入奶粉[30]。根据靶向DNA的高特异性,运用基因组学的方法也可以准确鉴别牛乳、水牛乳、羊乳等等,但是准确定量还有一定的难度[31-32]。Majcher等[33]利用气相色谱-质谱结合代谢组方法以及化学计量学数据处理方法,可以准确鉴别传统手工艺制作的奥西佩克奶酪和工业化生产的奥西佩克奶酪。蜂蜜是很受消费者欢迎的食品。不同种类花的蜂蜜不仅口感不同,其营养价值和价格也大不相同。Jandric等[34]利用代谢组学方法,结合液相色谱-质谱,傅里叶变换红外光谱等手段,建立了鉴别三叶草、麦卢卡、拉塔、卡玛西四种新西兰蜂蜜的方法。基因组学方法也可以提取蜂蜜中的物种特异性信息,确定蜂蜜的植物学和昆虫学起源,从而鉴定蜂蜜真伪[35-36]。组学技术可以准确鉴别葡萄酒真伪、产地。采用基因组学技术,对DNA来源进行分析,可以鉴别葡萄酒真伪[37]。采用蛋白组学方法,MALDI-TOF-MS技术可以准确鉴别33种克罗地亚白葡萄酒[38]。采用代谢组学技术,通过对葡萄酒中挥发物的分析,即可判断酿酒葡萄的品种和产地[39]。利用代谢组学方法还可以将有机种植的胡萝卜[40]和大麦[41]与普通的胡萝卜和大麦区别开来。代谢组学方法可以对咖啡质量和来源进行评价,阿拉卡比咖啡质量要好于罗布斯塔咖啡,在阿拉卡比咖啡中掺入罗布斯塔咖啡也是常见的咖啡造假手段,核磁共振技术可以检测低至2%的罗布斯塔咖啡[42]。使用单核苷酸多态性基因分型可以确定5个最常见的希腊橄榄油品种[43]。基因组学和代谢组学技术均可以检测橄榄油中是否掺入玉米油、大豆油、葵花籽油、花生油等其他食用油。[44-45]3.4转基因食品的检测。转基因技术通过生物工程技术将一种或几种外源性基因转移到某种特定的生物体内,使其表达出相应产物,以转基因生物为原料加工生产的食品就是转基因食品。关于转基因食品的安全性,目前仍存在争议。Tan等[46]应用蛋白组学技术研究了转基因玉米和非转基因玉米的蛋白质组差异,结果发现两者之间存在148个差异表达的蛋白质,其中42个在转基因玉米中表达较高,106个在非转基因玉米中表达更高。基于液相色谱-质谱技术自上而下的蛋白质组学技术,可以检测抗草甘膦玉米(NK603)中117种蛋白质表达变化[47]。转基因玉米的代谢组学分析中[48],抗草甘膦玉米(NK603)的几种胺类代谢物(例如:尸胺、腐胺、N-乙酰尸胺、N-乙酰腐胺)相比非转基因玉米有显著提高。Catchpole等[49]启动快速代谢组“指纹图谱”,比较了转基因土豆和非转基因土豆的总代谢物,发现转基因土豆与传统品种差异不大。代谢组学技术也已应用到对转基因大米[50,51]、转基因番茄[52]等转基因食品的分析。实时PCR(real-timePloymeraseChainRactione,rtPCR)是欧盟法规规定的评估转基因食品的唯一有效方法。微滴式数字PCR技术(dropletdigitalPCR,ddPCR)可以对食品中的植物源转基因成分进行分析[53]。Kosir等人结合基因步行(GeneWalking,GW)和下一代基因测序技术,可以同时检测混合物中低至1%的转基因玉米(MON810、MON89034、MON88017)和棉籽(MON1595)[54]。

基因组学方法篇(2)

基因在决定个体表型方面起着决定性作用，通过赋予个体对疾病的易感性或抵抗力，以及影响机体与环境因素的相互作用，基因对疾病的发生起着间接或直接作用。因此，人们希望通过识别疾病相关基因，以最终实现疾病的基因诊断和基因防治[1]。

因绝大多数疾病是多个微效基因协同作用并与环境因素共同导致，此类基因赋予患者易感性，故称为疾病易感基因(susceptibility genes)。随着分子遗传学和人类基因组计划的发展和实施，分析复杂疾病的遗传因素，定位疾病易感基因成为可能，从而为疾病的早期诊断和预警带来了希望[2]。迄今为止，对符合孟德尔规律的单基因病已经建立了一套行之有效的研究体系并定位克隆了近千个致病基因。但对于多基因病，因其不完全符合孟德尔规律，所以在其易感基因的定位和遗传分析中仍存在很多问题。多基因病易感基因的定位和遗传分析成为近年来医学遗传学研究的热点和难点。

多基因病涉及的主要为一些常见疾病，如原发性高血压、糖尿病、哮喘、银屑病、神经及精神疾病等，其群体总患病率近6 %[3]。它们虽有一定程度的家族倾向，但不遵从典型的孟德尔遗传规律，其表型与基因型之间的关系错综复杂，对其致病基因的分离尚缺乏成熟的技术，必需在人群与遗传标志的选择、数学模型的建立、统计方法的改良等方面进行不断的探索和艰苦的工作。当今国内外学者所采取的基本策略主要是从改进实验技术和遗传分析方法等方面开展研究，其中常用的方法是大规模全基因组扫描和分型的连锁分析[4，5]，即首先选定研究样本如家系、同胞对或人群，用遗传位标对样本成员针对全基因组、某染色体区段或某候选基因进行扫描，最后将所得数据用相应统计方法分析，确定哪些区段或基因与所研究的疾病间存在连锁或相关关系。

一、全基因组扫描策略

全基因组扫描(genomewide search)利用DNA多态性标记(主要是微卫星DNA)或消减杂交等策略，对基因组逐个点进行筛查，进行全基因组扫描，寻找与疾病相关的易感基因。用多态性遗传位标对样本个体进行基因扫描和分型，定出每一个体遗传位标的等位基因。用统计软件(如GENEHUNTER等)进行遗传统计分析，确定与疾病相连锁的染色体区段，通过增加扫描密度或单倍型分析等方法，将定位区域尽可能缩小。遗传位标目前大多采用微卫星多态标记(short tandem repeats， STR)，单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms， SNP)被认为是很有前途的新一代遗传位标。

1.样本的收集和提取DNA样本：当前全基因组扫描基因定位主要是采用以家系为基础的分析方式。

选择理想家系。所谓理想家系应符合(1)诊断准确，且为迁移较小、相对封闭的人群;(2)家系的数目及大小需达到一定要求;(3)有明确的遗传相关数据，如遗传方式、遗传度、外显率等。家系材料的收集应尽可能全面，包括血液样本、组织切片、分离的细胞株、临床检验结果等[6]。

此外，还有以患病同胞对、核心家庭或以人群为基础的分析形式，选择相对应的不同样本。

2.DNA短串联重复序列STR方法：(1)选择与制备。全基因组扫描中利用的微卫星标记，是一种广泛存在于人类基因组、以2～6个碱基为单位、串联重复排列的序列，具有高度的多态性，并以孟德尔共显性遗传，可以作为一种遗传标记。目前商品化的AB I PR ISMTM Linkage Mapping Set(PE公司出品)共包含400个STR，分辨率达

在上述区段内选择覆盖密度更高的微卫星标记，进行精细定位，尽量缩小致病基因的范围，明确基因位点。第三代遗传标志系统—单个核苷酸多态性，因其数目更多、覆盖密度更大(有可能达到人类基因组遗传多态性标志位点数目的极限)，故在基因定位研究中具有其它标志系统不可比拟的优越性和潜力，目前被大量使用。

3.SNP的发展：1990年开始启动的人类基因组计划(human genome project， HGP)揭开了人类遗传信息的秘密。随着研究的深入，人类基因组单核苷酸多态性( single nucleotide poly-morphisms， SNPs)的研究应运而生，并且得到迅猛的发展。SNPs数量大、分布广且在不同人群中的分布频率也有差异，这些差异可以代表某一种族或人群间的遗传差异[8]。SNPs是指基因组DNA序列中由于单个碱基(A、T、C、G)的变异而形成的多态性，并且这种变异人群中出现的频率大于1 %[9]。SNP的位点及其丰富，几乎遍及整个基因组。据估计基因组中大约平均每1 000 bp，就会出现一个SNP，这样SNP在整个基因组的分布就会达到300万个。

由于SNP在基因组中的高密度的特点，与以前的微卫星或其它遗传标记相比，利用SNP可以在上述的研究中对目的片段或基因作出更加精细的标定，从而使研究不断深入。目前，几个相对有前景的半自动或全自动地进行大量SNP检测的方法已经初露端倪。包括小型测序、多重反向点杂交、DNA芯片或微列阵，以及TaqMAN的方法[10]。

4.基因芯片:基因芯片的基本原理是应用已知的核苷酸序列作为探针与标记的靶核苷酸序列进行杂交，通过对信号的检测进行定性与定量分析。它将许多探针同时固定在同一芯片上，在一次试验中，可以同时平行分析成千上万个基因[11]。因此它和传统杂交法相比具有操作简单、效率高、成本低、自动化程度高、检测靶分子种类多、结果客观性强等明显的优点。

基因芯片现已广泛使用于基因表达分析，疾病诊断与治疗等方面。例如基因芯片技术对血友病、杜氏肌营养不良症、地中海贫血、异常血红蛋白病、苯酮尿症等的检测均已取得了较大的成功[12]。随着“人类基因组计划”和“后基因组计划”的开展，越来越多的遗传病相关基因会被揭示出来，这为在基因水平上揭示遗传病，并进行早期诊断奠定了基础。

二、全基因组扫描数据分析方法

1.连锁分析:在遗传过程中，2个基因或遗传标志被一起分配到子代而不发生交换，称为连锁(linkage)。两个基因位点发生交换的可能性反映了这两个基因的遗传距离，所以由标记位点与疾病位点间的重组率可估算出两者间的遗传距离及连锁程度。根据疾病有无合适的遗传模式，可分别进行参数分析与非参数分析。(1)参数分析法。亦称模式依赖的连锁分析法，即一般所指的连锁分析法。两位点连锁分析最常用的是LODS 连锁分析，即对数优势计分法(log odds score ，LODS) 是基于最大似然比检验的参数连锁分析方法[13]，主要检测在两基因以某一重组率相连锁时，出现这种情况的似然性有多大。该分析方法利用一个家系中所有成员之间的遗传信息，适用于已知遗传方式的单基因遗传病的基因定位。目前该计算有相应软件包可供使用，如Linkage， Lipid，Vitesse，Gene， Hunter[14～17]等。(2)非参数分析法。此法不依赖于疾病的遗传模式，被认为是多基因疾病的理想分析法。其研究对象限于家系中成对的患病成员，常用的非参数分析法有患病同胞对法和患病家系成员法。但非参数分析法在检出效力及分析可靠性上较参数连锁分析低，它也不能象LODS法那样得出遗传标记和易感基因之间的距离。患病同胞对法(affected sibpair ，ASP)原理是，如同胞对均为患者，他们将共有带有致病基因的那段染色体，通过标记物确定个体的基因型，可找出染色体上共有超出理论值的区域，从而对疾病基因进行定位。患病家系成员法(affected pedigree member ，APM)原理与ASP法相同，只是把研究对象扩展到整个家系的所有成员(包括患病的成对远亲)，从而解决ASP法分析时家系资料不足的问题，其分析遗传标记和易感基因连锁的有效性则比ASP低。它只能确定致病基因与一个较大的染色体区域的连锁关系，而不能用于致病基因的精细定位[18]。目前，APM法较多用于同胞对收集较困难的晚发性多基因遗传病的遗传分析。

2.人群相关性分析:在一个群体中设立病人组和对照组，确定遗传位标频率在两组中是否存在差别，即分析遗传位标基因型与性状基因间有否连锁不平衡，进而在该遗传位标附近寻找目标基因。选用隔离人群进行连锁不平衡分析更为理想。

3.传递- 连锁不平衡检验：染色体上遗传位标与疾病位点间的距离较近，它们在传递过程中一起传递给子代，表现为共分离，即连锁不平衡(linkage disequilibrium )[19]。由于群体相关分析可能产生因群体分层而导致的假阳性，近年来有人提倡用患者核心家系成员(双亲及同胞)作为相关分析对照组，即Spielman创立的传递- 连锁不平衡检验(transmission/disequilibrium test， TDT)[20]。TDT基于连锁不平衡的分析方法，一般用于亲代的标记等位基因是杂合型，观察可能的易感标记等位基因传递给患病子代的概率。一般情况下，当通过病例-对照研究已经揭示在人群水平上某标记位点与某性状(如疾病)间存在某种关联性(无论是真实还是虚假的关联)时，进行传递/不平衡检验可排除可能的虚假关联[20]。

三、展望

多基因病的遗传模式尚未确定，性状的变异往往受众多基因与环境的共同调控，相互间又存在一定程度的互作[21]。基因与基因间、基因与环境因素间的相互作用到目前为止还无法检测，所以多基因疾病的定位结果往往不尽如人意。然而SNP和DNA芯片等新技术的出现，为多基因遗传病易感基因的定位展示了广阔的前景。多基因疾病的发病存在种族、地区差异，所以易感基因的定位应开展国际性各地区多个实验室合作研究。我国地大人稠、民族众多，由于历史、地理、传统等原因，保存着许多相对隔离群体，这是我们开发人类疾病相关基因研究一项不可多得的资源优势。充分利用我国丰富的家系资源，迅速开展多基因疾病全基因组扫描和分型的连锁分析、相关分析研究，对推动我国多基因疾病研究和提高我国人类遗传学科研水平具有极为重要的现实意义。总之，重视遗传统计学和生物信息学的发展，易感基因的定位才能有所突破。

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基因组学方法篇(3)

关键词：学习动机；思想政治课；团体辅导；大学生

中图分类号：G641 文献标识码：A

1 引言

团体心理辅导的理论和方法自20世纪90年代介绍到我国大陆以来，获得了蓬勃的发展，目前它在心理健康方面得到了广泛的应用，而且取得了较好的实证效果[1～5]。而在目前的高校思想政治理论课程的教学中，仍以传统讲授式教学方法为主，学生的学习动机不足是影响教学效果的一个重要问题。那么如何改进教学方法，从而提高学生对这类课程的学习动机呢？由于团体辅导本身的特点和优势[6]，以及与高校思想政治教育在一些方面的共通性[7]，能否把团体心理辅导的方式应用到高校思想政治理论课程中，以促进学生对这类课程的学习动机，从而提高教学的时效性呢？本研究以参加高等院校四门政治理论课之一的《思想道德修养与法律基础》课程（以下简称《基础课》）的学生为研究对象，拟通过准实验的设计的方式对比团体辅导式教学与传统教学对学生学习动机的不同作用机制，以考察团体辅导式教学的干预效果及机制。

2 研究方法

2.1 研究被试

采用整群抽样法，抽取武汉市综合性重点大学的2010级大一学生6个班参加本次研究，总人数为897人，其中，男生占总人数的59.4%，女生占总人数的40.6%；汉族学生占到了总数的93.8%；在专业分布上，工科学生占总人数的55.4%，而文科占总人数的23.7%，商学为2.1%，医学为15.5%，理科为3.3%。

2.2 研究设计

本研究采用准实验设计，在自然状态下选择6个班分为实验组、控制组、对照组三个组别，每个组别两个班级。其中，实验组和对照组的被试都接受《基础课》的教学，但是两组使用的教学方法不同。实验组采用团体辅导式教学方法，而对照组采用传统讲授式教学方法。同时，两组在教学内容、教学老师和教学时间段等方面相同。而控制组在干预时间段内，不做特殊处理，他们在自然状况下进行正常的学习和生活。同时，在实验阶段，他们没有接受《基础课》的教学。在干预前后分别对三个组别使用同样的问卷进行测量，以考察干预效果。

2.3 研究工具

2.3.1 大学生《基础课》学习动机问卷

采用自编的“大学生《基础课》学习动机问卷”进行干预的前后测。该问卷由20个项目组成，分属四个维度，分别为：认知修养动机、情绪情感动机、人际互动动机、获得认可动机。量表采用5点计分。得分越高表示学习动机越强。经过检验，总问卷的内部一致性系数为0.92，四个因子项目的内部一致性系数分别为：0.91、0.83、0.78、0.69。验证性因素分析结果为X2/df=3.65，RMSEA=0.045，NFI=0.985，RFI=0.980，CFI=0.989，IFI=0.989。结果显示该问卷具有良好的信度和效度。

2.3.2 教师教学态度他评问卷

该问卷有10题，总分为100分，由高校教务部组织学生给教师的教学态度进行打分，不同题目有不同的权重。它作为评价教师教学效果的一个指标，是独立于教师和学生以外的第三方进行的，可以保证结果的客观性。该问卷主要是对教师教学态度的评价，所以，可以作为评价教师教学态度及其对学生的期待的指标。该问卷将作为本干预研究的辅助工具来检测干预中的教师期待效应。

3 团体辅导方案的设置

本研究采用成长式结构性团体，团体规模为120～150人，分成10～13个组，每组组长1名，副组长1名。团体领导者由具有5年以上该课程教学经验的老师带领，并有1名研究生作为助手。团体活动共18次，每周1次，持续18周，每次活动时间为1.5h。

本团体辅导法以认知行为主义、人本主义为理论基础，整体目标是帮助学生树立正确的世界观、人生观、价值观、道德观和法制观，打下扎实的思想道德和法律基础，提高自我修养，促进大学生德智体美全面发展。团体阶段目标为：①适应大学生活、学习；②树立理想信念、理国；③人生观、价值观的探索与树立；④提升道德意识与道德行为；⑤具备社会主义法律意识。

4 研究结果

4.1 干预前各组的学习动机基线水平比较

以不同组别为自变量，以大学生《基础课》学习动机的前测总分和各个维度分为因变量，进行单因素方差分析。其中，自变量具体而言有以下类型：使用团体辅导教学方法进行《基础课》的教学的班级为实验组，使用传统教学方法进行《基础课》教学的班级的为对照组，不进行《基础课》教学的班级为控制组。在三组都没有进行学习动机的干预以前，对其进行前测，结果如表1。

从结果可以看出，在干预以前，三组在学习动机总分以及各个维度上都有显著性的差异。使用LSD法进行多重比较，结果发现，在《基础课》学习动机的总分、情绪情感动机维度和获得认可维度上，控制组的分数显著高于对照组和实验组（P0.05）。在认知修养动机维度和人际互动动机维度上，控制组和对照组的分数显著高于实验组（P

4.2 干预后团体辅导组与其他组别的学习动机结果比较

自变量同上，以大学生《基础课》学习动机的总分和各个维度的后测分数为因变量，进行单因素方差分析。经过4个月左右的干预，结果如表2。

从以上结果可以看出，大学生学习《基础课》的动机总分上存在显著差异。具体到学习动机各个维度，在认知修养动机、情绪情感动机和人际互动动机等方面三组都有显著性的差，而在获得认可动机维度方面三组没有显著性的差异。

使用LSD法进行多重比较，结果发现，在《基础课》学习动机的总分上，实验组的分数显著高于对照组和控制组，而对照组与控制组没有显著性的差异。在学习动机的具体维度上，实验组的认知修养动机和情绪情感动机得分显著高于其他两组，而对照组与控制组差异不显著。在人际互动动机维度上，除了实验组的分数显著高于对照组和控制组以外，对照组的分数也显著高于控制组。而在获得认可动机维度上，三组没有显著差异。

将研究结果对照研究假设，发现在学习动机总分方面，研究假设得到部分验证；在学习动机之认知修养动机、情绪情感动机两方面，研究假设也是部分得到验证；在人际互动动机维度上，研究假设得到完全验证，而在获得认可动机维度上，研究假设没有得到支持。这说明，使用传统讲授式教学方法除了在提高学生人际互动动机方面有显著性的效果，在其他方面效果不明显，而团体辅导教学方法可以显著提高学生对《基础课》的总体学习动机。

4.3 同一组别中的《基础课》学习动机干预效果检验

实验组、对照组、控制组分别进行配对样本T检验，以进一步考察不同教学方法对学习动机的干预效果。结果如表3。

从以上结果可以看出，控制组在人际互动动机维度上，前后测没有显著性的差异。而在学习动机的总分以及其他维度上，后测分数都显著的低于前测分。这说明，没有进行《基础课》教学的班级，对《基础课》的学习动机有个自然下降的过程，而且这个下降的幅度还是非常显著的。

对照组除了在认知修养动机方面，后测显著低于前测，在其余的维度以及动机总分上，前后测都没有显著性的差异。结合控制组的前后测比较结果，对照组的前后测比较结果说明：使用传统讲授式教学方法对大学生学习《基础课》的动机有部分干预作用，虽然没有显著提高学生《基础课》的学习动机，但是避免了学生总体学习动机的自然下滑。而在认知修养动机方面，传统讲授式教学法无法显著阻止学生学习动机的下滑。

可动机上，则是后测显著低于前测。在认知修养动机和情绪情感动机两个维度上，前后测没有显著性的差异。结合控制组和对照组的前后测结果，实验组的前后测结果表明，使用团体辅导的教学方法不仅阻止了学生学习《基础课》的总体学习动机下滑，还显著提高了对课程的学习动机，具体而言，其显著提高了学生对《基础课》的人际互动动机，有效阻止了认知修养动机和情绪情感动机的自然下滑，并显著降低了学生学习《基础课》的获得认可这一外部动机。因为获得认可动机指的是希望在课堂上得到老师和同学的肯定而学习的动机，属于外部动机的范畴。

4.4 教师期待的组间差异

在进行实验的过程中，我们尽量减少额外变量对实验结果的影响。为此我们设计为同一名教师对实验组和对照组进行教学。同时，为了检验教师期待是否对实验结果造成额外的影响，我们使用“教师教学态度他评问卷”的得分为因变量，以实验组与对照组为自变量，进行独立样本T检验。同时这次施测每个班至少有30名同学参与评分，也保证了样本的代表性。T检验的结果显示，实验组（M±SD=91.73±2.22）与对照组（M±SD=91.09±2.38）的教师在教学态度以对学生的期待方面没有显著性的差异（T=0.707，P=0.484）。这说明，从统计学指标而言，教师的态度以及期待没有显著影响实验结果的科学性和客观性。

5 讨论

5.1 干预前三组的思政课学习动机的组间差异

从以上结果可以看出，在干预以前，实验组在《基础课》学习动机的总分以及各个维度上的分数都显著低于控制组，同时在认知修养动机维度和人际互动动机维度上显著低于对照组，而在情绪情感动机维度和获得认可动机维度上的则与对照组没有显著性差异。产生这一结果的主要原因在于研究者是在自然状态下随机选择实验组、对照组和控制组，这样就无法保证三组在干预以前处于相等的状态。之所以会选择在自然状态下随机选组，是为了不破坏正常的教学秩序，最大程度上接近真实的教学情境，以提高实验的外部效度，便于在真实的教学情境中推广本实验的研究结果。另一方面的原因在于现实条件的限制。如果根据90后大学生《基础课》学习动机的调查结果来选择在基线水平上相等的三个组别，无疑可以提高实验的内部效度，但是在现实条件下，研究者无法根据实验的需要自由选择教学的班级，而是受制于学校的统一安排。所以就造成了实验组、对照组以及控制组在干预以前差异显著的状况。虽然前测中实验组的学习动机显著低于对照组和控制组的，但经过研究者的干预后，实验组的学习动机显著高于另外两组的话，更加说明了团体辅导法对于提高90后大学生学习动机具有显著性的作用了。

5.2 团体辅导教学法的干预效果

从以上结果可以看出，总体而言，团体辅导的教学方法较之传统的教学方法而言，可以显著提高大学生“基础课”的学习动机。具体而言，团体辅导的教学方法可以让学生从《基础课》中获得有关理解他人、认知自我、提高适应力和道德修养等方面知识，在学习过程中体会到愉快、高兴、释然的感受，并有更多的机会与老师和同学进行交流。而至于传统的教学方法在学习动机的总分以及认知修养动机维度、情绪情感动机维度上，与不进行《基础课》教学的控制组班级，没有显著性的差异。这说明了传统教学方法在提高学生《基础课》的学习动机方面，效果并不明显。综上所述，团体辅导法的教学效果优于传统教学法。

对于同一组别前后测配对样本T检验的结果，使用团体辅导教学方法可以显著提高大学生《基础课》的学习动机，而使用传统的教学方法进行《基础课》教学，前后测的学习动机没有显著性的差异，而不进行《基础课》教学的班级，其《基础课》的学习动机有一个显著的下降过程。

具体而言，使用团体辅导教学方法，同学们觉得最大的收获是获得了很多与教师和同学互动的机会，满足了他们人际互动的需要。这是因为团体辅导法采取分组讨论的形式，给予了同学们一个互动的平台，同时任课教师鼓励同学们进行积极的交流，努力为他们营造一个平等、宽松、相互尊重和信任的团体氛围，这增强了组员对团体的归属感，增加了学生的互动，满足了其人际互动的需要[7]。同时，由于他们对《基础课》的内部动机提高了，所以，在外部动机方面，也就是获得认可动机方面反而会下降。

对于对照组，也就是使用传统教学方法进行《基础课》教学的班级，从结果中我们可以看到，在认知修养方面，学生感到自己的收获与预期相差甚远。使用传统教学方法无法显著提高学生对思政课的学习动机。

而对于控制组，也就是没有进行《基础课》教学的班级，在学习动机的总分以及其他的维度上，都有一个显著下降的过程。这可能因为学生对思政课的学习动机本身有个自然下降的过程，也可能跟额外变量对实验结果的干扰有关。比如，思想成熟可能是一个重要的额外变量。对于刚入学的大学生而言，他们对学校各类课程的期待可能存在一个过高的现象，而经过一段时间的学习后，他们对大学的认识逐渐深入，思想更加成熟，从而对课程的期待也有一个理性回落。再者，实验的前测与后测实施的环境不同，主试的不同等都有可能对实验结果造成干扰。当然，这一结果也在一定程度上说明了传统的教学方法也存在一定的效果，因为其可以维持学生对《基础课》的学习动机的水平保持相对稳定，而避免了学习动机的自然下降。

6 结语

团体辅导教学法可以显著提高大学生思政课的总体学习动机，尤其体现在激发了学生的人际互动动机。同学们觉得用团体辅导法教学的最大的收获是获得了很多与教师和同学互动的机会，满足了他们人际互动的需要。这基于团体辅导法为学生营造一个平等、宽松、相互尊重和信任的团体氛围，使同学们在互动的平台上彼此进行积极的交流，增强了组员对团体的归属感，满足了其人际互动的需要。另外，由于团体辅导法相比传统讲授式教学法更加激发了同学们对思政课的内部动机，而外部动机也相应地转化为了内部学习动机，进一步促进了学生对高校思政课学习内容的认同与内化，提升了教学实效性。

参考文献：

[1]Aghrafie M. The effect of Rogeian group counseling on the self-esteem of female students with intellectual disabilities[J]. Journal of Applied Research in Intellectual Disabilities，2006（19）：273.

[2]Branson B M， Peterman T A， Cannon R O， et al. Group counseling to prevent sexually transmitted disease and HIV： A randomized controlled trial[J]. Sexually Transmitted Diseases，1998（25）：553～560.

[3]Hutchinson N L， Freeman J G， Quick V E. Group counseling intervention for solving problems on the job[J]. Journal of Employment Counseling， 1996（33）：2～19.

[4]Larkin R， Thyer B A. Evaluating cognitive-behavioral group counseling to improve elementary school students’ self-esteem， self-control， and classroom behavior[J]. Behavioral Interventions， 1999（14）：147～161.

[5]Taft C T， Murphy C M， Elliott J D， et al. Attendance-enhancing procedures in group counseling for domestic abusers[J]. Journal of Counseling Psychology， 2001（48）：51～60.

基因组学方法篇(4)

关键词：5-Aza-dC；人胃癌细胞株；SGC-7901 Runx3基因甲基化

【中图分类号】R735.2 【文献标识码】A 【文章编号】1672-8602（2015）04-0555-01

胃癌是一种发病率较高的恶性肿瘤，也是导致我国人民死亡的主要病因，该疾病在我国的死亡率和发病率均明显高出世界平均值?化疗药物治疗和手术治疗是胃癌患者首选的治疗措施，然而，有相当一部分患者确诊时已经为晚期，因而手术治疗效果较差，化疗药物也仅仅对于部分患者有效，且会导致患者出现一定的不良反应症状?医学研究结果证实，DNA甲基化在胃癌的发生和发展过程中起到了重要作用，因此，抑癌基因异常甲基化状态的逆转是一种较为有效的胃癌治疗方法?本次医学研究就对5-Aza-dC及TSA对人胃癌细胞株SGC-7901 Runx3基因甲基化和表达水平的影响进行了分析，现报道如下?

1 资料和方法

1.1 材料

本次医学研究所用材料包括：北京中杉金桥公司生产的β-Actin一抗?二抗，博奥森生物技术有限公司生产的Runx3兔抗人多克隆抗体，TAKARA公司提供的探针和引物，Fermentas公司生产的dNTP和Taq酶，Promega公司提供的RTPCR试剂盒，Invitrogen公司提供的RNA抽提试剂TRIzol，TAKARA公司提供的Real Time PCR试剂，GEPIGENTEK公司提供的DNA修饰试剂盒，TIANGEN公司提供的DNA提取试剂盒，GIBCO公司提供的RPMI1640培养基和胎牛血清，安徽医科大学分子生物学实验室提供的胃癌细胞?

1.2 方法

1.2.1 各组细胞中Runx3基因mRNA的表达

根据TRIzol试剂盒要求对各组细胞RNA进行提取，将其逆转录为cDNA，根据反应条件进行5min的95 ℃预变性扩增，分别在95 ℃ 30 s?52 ℃ 30 s?72 ℃中进行35个30 s的扩增循环，后用琼脂糖凝胶电泳试验对结果进行验证，通过Quantity One软件进行β-Actin基因和Runx3基因条带灰度值的分析，进行3次相同的实验，并对各组灰度值比值的mean±SD进行计算，以此作为Runx3 mRNA表达水平的结果?

1.2.2 各组细胞中Runx3基因蛋白的表达

按方法提取各组细胞蛋白，通过BCA蛋白浓度测定试剂盒对蛋白浓度进行测定，调节后的蛋白加上缓冲液煮沸5 min，保证其完全变性，通过15 V恒压和15%SDS-PAGE凝胶电泳进行30min的半干转膜，将凝胶上的蛋白置于PVDF膜上?在室温下用脱脂奶粉50g/L进行PVDF膜的1h封闭，加入一抗稀释液，在4 ℃环境中过夜孵育，后使用TBST漂洗PVDF膜进行4次8 min漂洗，加入二抗稀释液，连续1h在37 ℃环境中孵育，最后使用TBST漂洗PVDF膜进行4次8 min漂洗[1]?

1.3 统计学处理

本次医学研究通过SPSS17.0软件分析和处理所得数据?计数资料通过X2检验方法进行统计学处理，计量资料通过（x±s）方法进行统计学处理和表示，其他数据资料通过单因素方差分析法进行统计学处理，如果所得分析结果P

2 结果

设定对照组甲基化水平为1，则其余各组细胞加药后，TSA组甲基化水平为0.63，5-Aza-d C组甲基化水平为0.7，TSA+5-Aza-d C组甲基化水平为0.37?各组细胞的Runx3基因的mRNA相对表达量为：对照组（0.14±0.04），5-Aza-d C组（0.29±0.02），TSA组（0.28±0.03），TSA+5-Aza-d C组（0.45±0.02），对照组相对表达量与各组相对表达量相比具有明显的统计学差异（P

3 讨论

肿瘤学研究结果提出，基因表达遗传学改变和遗传基因缺陷是诱发恶性肿瘤的主要原因，缺失和突变等基因缺陷均会对编码区功能和结构造成破坏，表观遗传学会诱导组蛋白乙酰化/去乙酰化或DNA甲基化等自身化学修饰方式发生一定的改变，进而达到DNA功能调控的作用[3]?mRNA表达水平结果证实，TSA和5-Aza-dC都会导致Runx3基因mRNA表达水平的增加，两药联合应用效果更加显著，由此可见，Runx3 mRNA启动子区甲基化水平与其表达水平之间存在直接联系，5-Aza-dC和TSA会对Runx3基因启动子区的异常甲基化状态产生逆转作用，进而形成Runx3基因的重新表达，并起到Runx3基因重新抑制癌症基因的效果?Runx3基因蛋白表达水平证实，各加药组m R NA表达水平越高，则蛋白表达水平也就越高，而这一结果也提高了实验结果的可靠性，并从蛋白表达水平的角度证实了5-Aza-dC和TSA的药效以及两药联合的协调作用?

参考文献

[1] 孟兰，程敏，沈国栋等.5-氮杂-2-脱氧胞苷和曲古抑菌素A对胃癌MGMT基因表达及NF-kB活性的影响[J].第三军医大学学报，2014，36（13）：1370-1371.

基因组学方法篇(5)

互动式教学是指在教学中通过教师与学生互动，学生与学生互动、教学与学生的互动，从而强化学习主体与周围环境、教学主体的交互影响，以产生教学共鸣共通，提高教学效果的一种教学模式和方法。

教无定法，学法也因人而异，公安院校执法执勤教学最终目地是培养学员在今后实际工作中遇到各类执法执勤问题时独立思考、分析、解?Q问题的能力，学员学会主动探索问题答案，具备一名初级警官的基本素质和任职资格。通过互动式教学，使学员能够在和谐、平等、开放的环境下进行“双向互动”的学习，不但能有效解决学员学习积极性不高的问题，而且能够培养学员团队意识和独立解决问题的能力，这与当前公安机关警务实战化形势需要是密不可分的。

1公安院校执法执勤教学互动式教学法运用应具备的基本条件

（1）基础知识的掌握。互动式教学法的前提必须是学生在对基本理论知识有所了解的情况下才能很好地实现互动。因此公安院校执法执勤教学互动式教学法应适用于前期经过基本理论教学，学员对执法执勤必备的公安业务理论知识、警务实战基本理论、执法执勤法律法规等有基本的掌握前提下才可以实行，学生互动的兴趣才能被调动起来，互动的过程才能顺畅，互动学习的效果才能得以体现。

（2）适时适度的评价。学员在掌握基本的执法执勤知识和技能后，根据自己掌握的知识针对执法执勤中存在的问题会提出各自的观点和看法，学员的观点与看法的正确与否，是否能够得到教员适时适度的点评，从而获得更为充沛的教学参与感和体验是互动式教学法关键的环节。教员的合理点评可以激发学员进一步探索和思考所学内容与实际工作的矛盾和冲突，从而为学员独立分析和解决问题能力的培养打下坚实的基础。因此无论学员观点正确与否，教员必须运用充足的理由来阐释正确或者错误的原因，进一步引导学员拓展学习的广度与深度。

（3）课堂有效掌控。课堂的有效掌控是促进互动教学效果的保证。有效掌控课堂是指教师在对课堂教学的内容、课堂教学秩序、课程进度安排等有效把握的基础上，合理调控课堂，调动学生学习情绪等能力的一种体现。因此互动式教学法的有效运用，必须建立在教师对课堂的有效掌控上，才能很好地实现。

（4）课后的反思。公安院校执法执勤课程的特点是围绕实际执法执勤工作需要，为培养符合第一任职需要的能力和素质而展开的。因此在具体教学中必须使学员掌握对某一类问题或者某一领域的问题解决方法，对于课堂中学员围绕问题进行的发言，必须由教员引导学员做出一一梳理和归纳总结，通过总结探寻自身在解决问题中错误或者忽视的原因，从而为学员掌握正确的处置方法带来更深刻的认识与反思。因此课后的反思与总结是互动式教学法必须遵循的原则。

2 公安院校执法执勤教学互动式教学法运用的总体思路

第一步，教员打破书本的便携顺序，按照课程的知识结构，统一讲解课程的基本构架和全书的基本理论知识，同时提供参考资料，让学员进行大量的课外阅读。第二步，把学员按小组编号，或者按照基层单位建制进行分工编组，指定学员发言，教员可以提前告知题目，由组内互助，按照绝对水平计分。第三步，按照各小组划分，进行综合讨论、自由发言，拓展知识面，密切联系实际。教员提前安排学员对执法执勤中各类经典案例或者现实、身边发生的事情进行讨论发言，交流观点和看法，最后提出解决问题的办法和思路。

3公安院校执法执勤教学互动式教学法的实现步骤

3.1 基础理论和实践应用的基本掌握

对理论基础讲授部分，教员将学员必须掌握和具备的业务理论知识打乱章节顺序进行讲授。这一部分以教员讲授为主，其中贯穿教员与学员之间提问式的互动，其他讨论式、案例式等具体教学手段也可以贯穿始终；对于实践应用部分，以学员自主课堂为主。教员通过典型案例引导、学员分组练习、学员示范演练等模式进行学习。通过教员引导和学员自学体会使学员掌握基本的理论知识和应用操作技能。

3.2 学员分组讨论学习

教员按照学员学习情况结合学员意愿对全体学生进行分组，也可以自由搭配。全体学生分为6～10组，每组设组长一名，组长轮流由各组员担任。组长负责组织本组的学习及课堂讲授等工作，同时负责向老师及其他组长汇报本组的学习及准备等情况。或者由任课教师指定教授内容，组长负责组织课堂学习，协调组员之间的学习进度，并有针对性地准备至少3个问题以备提问，要求组员之间相互讨论先行得出答案。由老师根据各组提交的问题质量的高低，指定某一学习小组组织课堂学习，教学方式手段不限，由老师与该小组组长协商指定某位同学担当主讲。由组织课堂的小组进行提问，并指定其余的小组进行回答。在每一问题回答结束后进行简单点评并给出初步分数。任课教师与各位组长协商给出参与课堂教学组的分数，计入考试成绩。其中分组讨论时可采取每组设基准分100分，课堂组织分为-10～50分，提问及回答分值为-5～10分的参考标准，在共计100分钟的授课时间里，学生自主组织课堂时间为70分钟，其他时间为老师点评及重点、难点讲授时间。

3.3 教员课堂点评

分组讨论结束后教员必须及时就点评分数和学员表现予以点评。一是由教师根据各组提交的问题质量的高低、回答问题的完成程度、回答问题的技巧及方法、学员执法执勤思维方式及方法等方面对学员分组讨论情况进行点评；二是根据分数高低情况进行点评，指出各小组高分、低分得分原因和分析差距所在。重点要对各小组讨论问题的争执点、不同点、差距点进行分析点评，使学员清楚执法执勤实际问题解决的多元性和复杂性，并理解如何运用理论解决实际执法执勤问题的规律；三是对课堂组织、提问问题、回答问题表现优异的学员给予表扬和鼓励，对于不认真参与和思考的学员指出其存在的问题，并分析原因。点评中必须注意切中要害，特别要结合执法执勤课程要解决现实执法问题的特点，通过适时适度的点评使学员掌握分析问题和解决问题的方法和思路，或者达到引发学员思考和探究的状态提高学员主动学习的积极性。

基因组学方法篇(6)

关键词：分子生物学；植物抗性基因；基因组

生物学研究正进入一个前所未有的新时期。大量数据、信息的获得，使得生物学研究各领域均有很大转变，其中包括植物抗性基因的研究。目前基因组研究已开始对植物生物学产生深远的影响，再过数年，人们将从当前的描述性研究很快过渡到从已有的大量数据信息中提出假说，经计算机模拟分析，最后针对性地设计实验来验证新的基因分析方法。实验将不再仅仅是分析基因――基因、蛋白质――蛋白质的相互作用，而是将获取大量的RNAs，蛋白质和相关代谢物等数据。

1 植物抗性基因研究现状

1.1 植物自身抗性基因以等位基因系和基因簇形式存在

经典遗传学研究表明，在不同植物品系的同一基因位点上可能具有等位基因，这些等位基因对各种病原具有不同的特异性。此外，抗性基因往往在某一特定区域成簇存在。事实上，在特定的染色体区域常常不能分辨抗性基因位点上真正的等位基因和有关联的成簇基因。利用具有不同抗性基因的植物进行杂交可以澄清这一问题。

1.2 植物抗性基因的作用机制

Flor是第一个在植物和病原中同时研究抗性遗传的植物病理学家，他研究亚麻和亚麻锈病病菌之间的相互作用。通过这些研究，他提出了基因对基因假说。研究表明，植物和病原的遗传组成和一株植物成功地进行防御是密切相关的。植物―病原相互作用的专一性是由病原的一个显性无毒基因产物和植物抗性基因产物间相互作用来决定的。因此，这两个产物之间特异识别是植物抗性作用的基础。这种识别触发了进一步的生理防御作用并导致超敏细胞死亡和对病原具有毒性的分子的积累。

1.3 植物抗性基因克隆

植物抗性基因的克隆目前主要采用转座子标记和定位克隆的方法，迄今为止，用这2种方法已克隆出22种抗性基因，其中用定位克隆方法得到16种，用转座子标记法得到6种。最近，有人又提出利用抗性基因类似序列（resistancegeneanalogs）通过PCR来特异扩增抗性基因的方法。

1.4 转基因改良植物胁迫耐性的困难及改进措施

尽管转基因改良植物胁迫耐性已取得一些进展，目前仍存在以下困难：目的产物表达量不够或时空表达不协调；目的产物翻译后修饰（加工或折叠）不适当，影响功能表达；目的酶所催化的代谢反应前体物质不足；细胞内目的酶活性受制于pH、温度及盐离子浓度等因素；有些目的表达产物对宿主细胞产生毒副作用等。进一步改进措施有以下几方面： ①选用来自近缘物种的目的基因；②构建高效表达体系；③表达产物的胞内区域化；④增加目的酶催化的前体物质含量；⑤目的产物翻译后修饰的调控；⑥抑制目的产物的副效应。

2 植物抗性基因研究趋势

基因的研究是指在许多基因同时存在的基础上对多个基因同时进行研究，分析各自与它们之间的结构与功能的相互关系。因而它至少涉及3个相关领域：结构基因组――主要关心DNA碱基序列水平上的基因结构；比较基因组――寻找种内、种属间产生基因结构差异的分子基础，以期获取与目的性状相关的基因；功能基因组――着重研究基因与其表达产物及功能活性的调控关系。结构基因组是其它领域的基础，比较基因组为功能基因组研究提供等位基因，蛋白质组则是在蛋白质水平上分析基因表达的功能基因组研究的派生分枝。生物信息学是在前面3者研究的基础上，获取、整理、综合分析提取大量已有复杂生物数据的新学科，对相关学科的研究有很大的推动作用。

基因组学（Genomics）的出现，使生物学研究进入一个新的时期，即由仅对一个基因的研究转向在基因组规模上同时对大量基因的结构和功能进行系统的研究。无论从思想上还是技术方法上，基因组学已经影响生命科学的各个领域，植物的抗逆性研究也不例外。利用基因组学的方法，不但可以挖掘大量的抗性基因，对其功能进行详细的研究，而且有助于全面理解植物的抗逆机理，为利用遗传工程提高植物抗性提供基础。

以基因组为研究对象的基因组学是常规的以基因为对象的分子生物学研究的一次飞跃。已有报道说明，基因组学方法在植物抗逆研究中的应用处于起步阶段，但随着基因组学研究的发展，我们获得大量与抗逆性有关的序列信息和生物功能信息，从而对植物抗逆复杂性会有更全面的理解。植物的抗逆性能往往不是由单基因决定的，而是由一系列相关的直接或间接作用的基因形成一个复杂的调控网络。在这个复杂的调控网络中，任何一个环节都可能是至关重要的。因而对植物抗逆性的提高，尤其对一些属数量性状的抗逆性，仅靠转移一个基因得到耐逆植物有一定的难度，转入一系列基因也许是必需的，即利用基因组工程，而不只是基因工程来提高植物抗性。基因组学的研究为植物抗逆遗传工程提供大量的全新基因，从而为抗逆育种提供了更广阔的前景。

3 展望

我们正经历一个快速发展的阶段，与几年前相比，已有许多那时想都不敢想的工具与能力。目前已开始从单个抗性基因的鉴定克隆转移到抗性基因表型的全面分析。可以预测，在不久的将来，不用通过实验鉴定，我们在计算机上通过序列比较和功能模拟分析，就能预测新克隆的抗性基因的功能。大规模的新方法、新技术的应用，将为我们获取新抗性基因并使之变成可操作利用提供机会。

参考文献

1 阎隆飞，张玉麟.分子生物学[M].中国农业大学出版社， 1997

基因组学方法篇(7)

论文关键词：生物信息学,计算机科学,基因组学

一． 序列比对

序列比对其意义是从核酸、氨基酸的层次来比较两个或两个以上符号序列的相似性或不相似性，进而推测其结构功能及进化上的联系。研究序列相似性的目的是通过相似的序列得到相似的结构或功能，也可以通过序列的相似性判别序列之间的同源性，推测序列之间的进化关系。序列比对是生物信息学的基础，非常重要。

序列比对中最基础的是双序列比对，双序列比较又分为全局序列比较和局部序列比较，这两种比较均可用动态程序设计方法有效解决。在实际应用中，某些在生物学上有重要意义的相似性不是仅仅分析单条序列，只能通过将多个序列对比排列起来才能识别。比如当面对许多不同生物但蛋白质功能相似时，我们可能想知道序列的哪些部分是相似的，哪些部分是不同的，进而分析蛋白质的结构和功能。为获得这些信息，我们需要对这些序列进行多序列比对。多重序列比对算法有动态规划算法、星形比对算法、树形比对算法、遗传算法、模拟退火算法、隐马尔可夫模型等，这些算法都可以通过计算机得以解决。

二． 数据库搜索

随着人类基因组计划的实施，实验数据急剧增加，数据的标准化和检验成为信息处理的第一步工作，并在此基础上建立数据库，存储和管理基因组信息。这就需要借助计算机存储大量的生物学实验数据，通过对这些数据按一定功能分类整理，形成了数以百计的生物信息数据库，并要求有高效的程序对这些数据库进行查询，以此来满足生物学工作者的需要。数据库包括一级数据库和二级数据库，一级数据库直接来源于实验获得的原始数据，只经过简单的归类整理和注释；二级数据库是对基本数据进行分析、提炼加工后提取的有用信息。

分子生物学的三大核心数据库是GenBank核酸序列数据库，SWISS-PROT蛋白质序列数据库和PDB生物大分子结构数据库，这三大数据库为全世界分子生物学和医学研究人员了解生物分子信息的组织和结构，破译基因组信息提供了必要的支撑。但是用传统的手工分析方法来处理数据显然已经无法跟上新时代的步伐，对于大量的实验结果必须利用计算机进行自动分析，以此来寻找数据之间存在的密切关系，并且用来解决实际中的问题。

三． 基因组序列分析

基因组学研究的首要目标是获得人的整套遗传密码，要得到人的全部遗传密码就要把人的基因组打碎，测完每个小的序列后再把它们重新拼接起来。所以目前生物信息学的大量工作是针对基因组DNA序列的，建立快速而又准确的DNA序列分析方法对研究基因的结构和功能有非常重要的意义。对于基因组序列，人们比较关心的是从序列中找到基因及其表达调控信息，比如对于未知基因，我们就可以通过把它与已知的基因序列进行比较，从而了解该基因相关的生理功能或者提供疾病发病机理的信息，从而为研发新药或对疾病的治疗提供一定的依据，使我们更全面地了解基因的结构，认识基因的功能。因此，如何让计算机有效地管理和运行海量的数据也是一个重要问题。

四． 蛋白质结构预测

蛋白质是组成生物体的基本物质，几乎一切生命活动都要通过蛋白质的结构与功能体现出来，因此分析处理蛋白质数据也是相当重要的，蛋白质的生物功能由蛋白质的结构所决定，因此根据蛋白质序列预测蛋白质结构是很重要的问题，这就需要分析大量的数据，从中找出蛋白质序列和结构之间存在的关系与规律。

蛋白质结构预测分为二级结构预测和空间结构预测，在二级结构预测方面主要有以下几种不同的方法：①基于统计信息；②基于物理化学性质；③基于序列模式；④基于多层神经网络；⑤基于图论；⑥基于多元统计；⑦基于机器学习的专家规则；⑧最邻近算法。目前大多数二级结构预测的算法都是由序列比对算法BLAST、FASTA、CLUSTALW产生的经过比对的序列进行二级结构预测。虽然二级结构的预测方法其准确率已经可以达到80%以上，但二级结构预测的准确性还有待提高。

在实际进行蛋白质二级结构预测时，往往会把结构实验结果、序列比对结果、蛋白质结构预测结果，还有各种预测方法结合起来，比较常用的是同时使用多个软件进行预测，把各个软件预测结果分析后得出比较接近实际的蛋白质二级结构。将序列比对与二级结构预测相结合也是一种常见的综合分析方法。

蛋白质二级结构指蛋白质多肽链本身的折叠和盘绕的方式。二级结构主要有α-螺旋、β-折叠、β-转角等几种形式，它们是构成蛋白质高级结构的基本要素，常见的二级结构有α-螺旋和β-折叠。三级结构是在二级结构的基础上进一步盘绕，折叠形成的。研究蛋白质空间结构的目标是为了了解蛋白质与三维结构的关系，预测蛋白质的二级结构预测只是预测蛋白质三维形状的第一步，蛋白质折叠问题是非常复杂的，这就导致了蛋白质的空间结构预测的复杂性。蛋白质三维结构预测方法有：同源模型化方法、线索化方法和从头预测的方法但是无论用哪一种方法，结果都是预测，采用不同的算法，可能产生不同的结果，因此还需要研究新的理论计算方法来预测蛋白质的三维结构。

图4.1 蛋白质结构

目前，已知蛋白质序列数据库中的数据量远远超过结构数据库中的数据量，并且这种差距会随着DNA序列分析技术和基因识别方法的进步越来越大，人们希望产生蛋白质结构的进度能够跟上产生蛋白质序列的速度，这就需要对蛋白质结构预测发展新的理论分析方法，目前还没有一个算法能够很好地预测出一个蛋白的三维结构形状，蛋白质的结构预测被认为是当代计算机科学要解决的最重要的问题之一，因此蛋白质结构预测的算法在分子生物学中显得尤为重要。

五．结束语

现如今计算机的发展已渗透到各个领域，生物学中的大量实验数据的处理和理论分析也需要有相应的计算机程序来完成，因此随着现代科技的发展，生物技术与计算机信息技术的融合已成为大势所趋。生物学研究过程中产生的海量数据需要强有力的数据处理分析工具，这样计算机科学技术就成为了生物科学家的必然选择，虽然人们已经利用计算机技术解决了很多生物学上的难题，但是如何利用计算机更好地处理生物学中的数据仍是一个长期而又复杂的课题。

参考文献：

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2. 张阳德.生物信息学.科学出版社[M],2004.

3. Dan E.Krane & Michael L.Raymer，孙啸，陆祖宏，谢建明译.生物信息学概论[M],2004.

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